2022 Fiscal Year Annual Research Report

多能性幹細胞から発生起源の多様性を反映した骨格筋への誘導と筋疾患研究への応用

Research Project

Project/Area Number	20J01478
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Kyoto University
Research Fellow	本田充京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(CPD)
Project Period (FY)	2020-04-24 – 2025-03-31
Keywords	筋ジストロフィー / FSHD / DUX4 / 多能性幹細胞 / 機能ゲノミクス
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、ヒト多能性幹細胞の利点を活かしながら、機能ゲノミクス的観点と発生学的観点からのアプローチによって顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)の病態理解を目指している。特に、FSHD発症において重要な転写因子DUX4の発現様式のメカニズムに着目している。まず、機能ゲノミクス的観点のアプローチにおいては、疾患特異的なクロマチン構造やエピジェネティックな特徴の理解を深めるため、クロマチン免疫沈降法や前年度から追加でのオープンクロマチン状態評価のための次世代シーケンサー解析について、細胞サンプル調整、ライブラリー作製、シーケンシングを実施し興味深い結果を得た。それらに基づくDUX4遺伝子発現の疾患特異的な発現制御機構の仮説を立証するため、ゲノム編集によって様々な変異導入株を作製し、筋分化時のDUX4発現量の評価をリアルタイムqPCRで行い有意義な結果を得た。次世代シーケンスデータ解析上の問題となっていたリピート領域のアライメントについて、アライメントツールのオプションの至適化を行うことで当該領域の定量評価が可能となった。また、ロングリードシーケンサーによる解析を行い、実際に用いている疾患株の配列を取得することで、アライメントの際に実際の使用細胞と異なる公共のレファレンスゲノムの配列を用いない、正確なショートリードシーケンサー解析パイプラインの準備を行なった。発生学的アプローチの観点からは、新規分化誘導法の確立については、現状の分化誘導系が安定して行えていることから進展はなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 機能ゲノミクス的観点のアプローチにおいては、次世代シーケンスを用いるいくつかの解析手法について初めて行う実験系も含めて実施し、有意義な結果を得ることができた。さらに、ロングリードシーケンスを用いる実験系を研究計画に新たに取り込んだことによって、従来想定していたより多くの情報が得られる展望ができた。また、重要な進展として、FSHDの発症に関わるリピート領域について、次世代シーケンスで得られたリードが通常のマッピングツールではアライメントされない問題があったが、ツールのオプションパラメーターの比較検討によって解決した。これにより、すでにこれまでに得られていたショートリードシーケンスのデータの再評価や、今後計画している様々な解析の定量評価が可能となった。仮説検証のための様々な変異導入クローンを作製し、筋分化クローンも複数株作製して、筋分化後のDUX4遺伝子発現量の影響をみたところ、仮説をサポートする結果を得た。一方、発生学的観点のアプローチについては、新規分化誘導法の検討については有意義な進展は得られなかった。
Strategy for Future Research Activity	機能ゲノミクス的観点のアプローチにおいては、得られた重要な疾患特異的エピジェネティックマーカーについて、追加でChIP, Cut&Run, ATACなどを行い、より詳細に特長を見る。変異株作製についてはさらに仮説実証に必要な変異導入株を作製し、順次DUX4発現への影響を評価する。さらに、こうした変異株について、DUX4プロモーター領域などのクロマチン構造を明らかにするため、Capture-C解析を行う。さらに、優位にコンタクトが見られた領域については、すでに別研究課題にて確立したdCas9-KRABの系を用いて、その制御領域としてのポテンシャルを評価する。発生学的アプローチについては、必要に応じて、分化誘導系の系統特異的な転写因子応用法を検討する。