2022 Fiscal Year Annual Research Report
DNAカーテン上の複製フォーク超複合体の一分子観察
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21J40128
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
寺川 まゆ 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 再構成 / 一分子観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA複製は生命にとって非常に重要なイベントの一つとして知られている。DNAが複製されるためには、最低でも約20種類におよぶタンパク質が各段階に応じて集まり、協同して働く必要があることが知られている。これまでに、分子生物学的な手法を用いて、数々のDNA複製関連タンパク質が同定され、その機能の一端が明らかにされてきた。しかし、これまでの分子生物学研究においては雑多な分子も多く含む細胞の抽出液が用いられてきたことから、DNA複製の詳細な分子メカニズムはあまりよく分かっていない。本研究では、再構成系の実験系を用いて、DNA複製反応を一分子観察することにより、生物物理学的視点でDNA複製反応を観察し、分子機構を明らかにしていこうとしている。
昨年度は、DNA複製に最低限必要なタンパク質の精製を終え、また精製したタンパク質のDNAへの結合能やunwinding能を調べた。今年度は、DNAカーテンをつくる技術を身に着け、精製したタンパク質の一部を用いて、タンパク質のDNAへの結合を一分子観察することを目指した。
まず、DNAカーテンの作成のために、スライドガラスへの表面加工方法や、スライドガラスへの電子線を用いたパターン描写テクニックを身に着けた。DNAカーテン法ではλDNAを用いるため、ファージの培養やλDNAの精製方法なども学んだ。精製したλDNAを組み立てたDNAカーテン用のチャンバーに添加し、DNAカーテンを作成することに成功した。そこに、精製したORC,Cdc6,MCM2-7,Cdt1を添加し、複製開始前複合体と呼ばれるDNA複製の初期段階に見られる複合体をDNAに結合したものを観察することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画段階において、２年目にはDNAカーテンを用いたDNA複製関連タンパク質のDNAへの結合観察をはじめる予定であり、その点において計画通り順調に進展していると言える。実際にORC・Cdc6・MCM2-7/Cdt1のDNAへの結合観察を行ってみると、MCM2-7のガラス表面上への非特異的な結合がみられたり、結合に大きなゆらぎがあるように見受けられ、再現性をとれる観察方法や観察条件の試行錯誤に時間を要している状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは、ORC・Cdc6・MCM2-7/Cdt1を安定的にDNAへ結合させ再現性よく観察できる実験条件の決定を行う。それができた後、DNA複製の次のステップであるDDKによるMCM2-7のリン酸化をチャンバー内で行うことを試みる。その後、機能のよく分かっていないMCM10に着目し、MCM10がダブルヘキサマーであるMCM2-7の解離に関与しているのか、またDDKによるリン酸化がその関与に影響し得るのかについて調べていきたい。
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