2022 Fiscal Year Annual Research Report
カイコ精巣をモデルとした幹細胞維持と配偶子形成に関与する新奇遺伝子の解析
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21J21572
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
柿野 耕平 九州大学, 生物資源環境科学府, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | カイコ / ゲノム編集 / 精子形成 / 機能未知遺伝子 / RNA-seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、「カイコ精巣をモデルとした幹細胞維持と配偶子形成に関与する新奇遺伝子の解析」を通した、鱗翅目昆虫だけが獲得した特殊な精子形成機構の解明である。そこで本研究は、NGS解析を用いて幹細胞維持機構と二型精子形成に関与する新奇遺伝子(鱗翅目昆虫のみに保存された機能未知遺伝子)を探索したのちに、ゲノム編集やin silico解析を用いてその機能を明らかにすることを目的としている。具体的には、以下の３つの項目に分けて研究を行っている。項目１：幹細胞維持機構の解明、項目２：二型精子の運命決定機構の解明、項目３：改良ノックイン法の開発。本年度は、昨年度の研究結果を踏まえ、以下の研究を行った。
項目１、2：昨年までに取得したカイコ精巣のRNA-seqデータの再解析を行なった。本年度は、これまでのデータに加え、公共のデータベース上に登録してある(１)カイコ組織のRNA-seqデータ、(2)ショウジョウバエの精巣のRNA-seqデータとの比較解析を行った。その結果、カイコの精巣でユニークに発現する機能未知遺伝子の存在を見出した。
項目１、2：本年度は新たに11遺伝子に対してCRISPR/Cas9を用いたノックアウト実験を行った。その中の１遺伝子のノックアウトホモ個体では、正常個体を交配実験において、雌雄ともに稔性の低下が確認された。さらに、精子の観察を行ったところ、正型精子である有核精子の核の局在に異常が生じていることが確認できた。この遺伝子は、項目２の２型精子形成に関与する遺伝子であることが示唆された。
項目３：ノックイン効率を好感度に検出するために、トランスジェニックカイコの作出に取り組んだ。その結果、レポーター遺伝子を発現する系統の作出に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
項目１, 2：RNA-seq解析及び、公共のデータベース・ツールを用いた in silico解析を行った。昨年度に行ったカイコ精巣を未分化・分化領域に分けたRNA-seq解析に加え、さらに、カイコの組織間、及び、ショウジョウバエのRNA-seqデータとの比較を行った。カイコの組織間のデータの比較では、1755遺伝子の精巣特異的な発現が検出された。このデータを昨年度のデータとの比較を行ったところ、未分化側で高発現していたのは77遺伝子、分化側で高発現していたのは1380遺伝子であった。ショウジョウバエで実施された、精巣の領域別の(apical〈未分化〉, middle〈分化〉, basal〈分化〉)のRNA-seqデータとの比較解析を行った。未分化領域では、分化領域と比べて発現パターンが保存されている遺伝子が比較的多く検出された。
項目1,２：本年度は新たに11遺伝子に対してCRISPR/Cas9を用いたノックアウト実験を行った。その中の１遺伝子のノックアウトホモ個体では、正常個体を交配実験において、雌雄ともに稔性の低下が確認された。さらに、精子の観察を行ったところ、正型精子である有核精子の核の局在に異常が生じていることが確認できた。この遺伝子は、項目２の２型精子形成に関与する遺伝子であることが示唆された。
項目３：昨年度までの実験系では、ノックイン効率が低い上に、対象としていた尿酸代謝遺伝子のXDH1遺伝子が組織特異的な発現をするために、本来のノックインの可否が検出できていなかった可能性が示唆された。そこで本年度は、遺伝子ノックイン効率を好感度に検出するためのレポーターカイコの作出に取り組んだ。強力でかつ、ユビキタスに発現するHSP90プロモーター下流に、EGFP-ΔATGを組み込むようにベクターを設計し、piggyBacを用いたトランスジェニック系統の作出を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は２つの観点から研究を推進する。
１つ目は、本年度の解析で異常が確認された機能未知遺伝子に対し、以下のアプローチで機能解明を試みる。組織学的解析：この遺伝子のノックアウト系統を用いて、精子形成のどのステージに影響が出ているのかをタイムポイントごとに解析する。また、この遺伝子の抗体を作製し、この遺伝子の生殖細胞内での挙動を解析する。生理学的解析：これまでの解析では、有核精子における核の局在異常が原因で稔性が低下したと考察している。しかし、この遺伝子の無核精子への影響は確認できていない。そこで、無核精子異常が生じるBmSlxIn3系統との交配実験を行い、この遺伝子のノックアウトによる無核精子への影響を解析する。
２つ目は、本年度に作出したレポーターカイコを使用して、効率的なノックイン条件を検討する。初年度に行ったように、ドナーの形状やドナー修飾及び、既報の薬剤によって、ノックイン効率が向上するのかを検証し、最適条件を決定する。
また、これまでの研究成果を投稿論文として発表する予定である。
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Research Products
(1 results)
