植物のオルガネラ特異的ステロール輸送マシナリーの解析

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J40112
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Japan Women's University
• Principal Investigator: 小林 啓子 日本女子大学, 理学部, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: 花粉 / 葯 / タペータム / ステロール / イソプレノイド / ポーレンコート

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、ERで作られるはずのステロールエステルがプラスチド由来のエライオプラストに蓄積するタペータム細胞に着目し、以下の２項目の実験により植物のオルガネラ間ステロール輸送機構の調査を計画している。
１、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測
これまでにステロール生合成などが異常となる変異体の葯を化学固定し、花粉の成熟過程でエライオプラストを含む脂質オルガネラの形態変化の違いを透過電子顕微鏡観察で見出してきている。化学固定は脂質の可視化に適している一方で、試料調整の過程でオルガネラの形の歪みなどの異常が生じる可能性がある。そこで、今年度は引き続き化学固定した葯の観察を進めるとともに、より生体内の状態に近いオルガネラ構造を観察出来るとされる、凍結固定を用いた観察も試みた。その結果、この固定法でも一部の変異体で脂質オルガネラの構造観察に成功した。化学固定では、良好な固定像を得ることが難しかった原色素体からエライオプラストの分化過程で、固定剤などの工夫によりERとの密接な接触が観察されてきている。凍結固定の結果と比較することで、エライオプラストの形成過程でERからどのように物質の輸送が行われるのか、明らかに出来るのではないかと期待している。
２、ステロール生合成酵素が局在するオルガネラの特定
タペータム生細胞で、ステロール生合成酵素がどのオルガネラに存在するのか調べるために、タペータム組織特異的に発現を誘導したステロール生合成酵素融合GFPなどを植物体に導入するためのベクター構築を行っている。今年度は、主なステロール生合成酵素の一つであるシクロアルテノール合成酵素mRNAの５‘末端配列を調べて、考えられうる最長の予測アミノ酸配列と開始コドンの位置を決定した。得られた情報を元にベクターを構築しており、シロイヌナズナに導入してGFP蛍光の細胞内局在を調べる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測
脂質の可視化が得意な化学固定法で固定した、ステロール生合成などが異常となる変異体などの葯サンプルの観察数を増やして、各発達ステージを捉えた像を揃えつつ再現性確認を行っている。その結果、野生型及びいくつかの変異体の葯において、エライオプラストが分化していく過程で、ERとの密接な接触が見られる良好な固定像を得ることができたため、エライオプラストへの分化や成熟に必要な物質がERから運ばれる機構の解明に迫ることが出来るのではないかと期待している。更に今年度からは生体内のオルガネラの形態を捉えるのに適しているとされる凍結固定法による観察を開始し、いくつかの変異体で脂質オルガネラの観察に成功した。脂質オルガネラの一つであるエライオプラストでは、内部顆粒の形を捉えることが出来た。各変異体と野生型の良好な固定像を得てこれらの結果を比較することで、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測が可能となると考えている。
２、ステロール生合成酵素が局在するオルガネラの特定
プラスミドベクター構築及び植物の遺伝子組み換えなどの分子生物学的解析が所属研究室では初めての試みであり、今年度までにベクター構築及び植物の遺伝子組み換えに加え、RNA抽出と5’ RACEなど基本的な分子生物学的実験系を立ち上げつつ実験を行った。コンストラクションが完了したものから順次、シロイヌナズナ植物体に導入中である。
進捗状況は、形質転換体を作成する項目２の実験で当初の予定よりはやや遅れているものの、項目１の実験では複数の固定法で多くの情報が得られており、全体としては概ね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

１、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測
今年度はより生体内の状態に近いエライオプラストの形態を調べるために、凍結固定を試みた。この固定法においても、着目している脂質オルガネラの構造を観察することに成功したので、更に未観察の変異体などの観察を行い、良好な固定像を揃えていく予定である。また、化学固定においても、引き続き各発達ステージを捉えた像を揃えつつ再現性確認を行う予定である。両固定法で得られた良好な観察像を比較することで、より生細胞に近い状態でのオルガネラと脂質の局在を明らかにしていきたい。
２、ステロール生合成酵素が局在するオルガネラの特定
今年度よりステロール生合成酵素の局在を調べることを目的として、タペータム特異的プロモーターで発現を誘導したシクロアルテノール合成酵素-GFP融合タンパク質を植物体に導入するためのベクターコンストラクションを行っている。今後は構築したベクター発現系をフローラルディッピング法でシロイヌナズナ植物体に導入して、GFP蛍光が細胞内のどのオルガネラに局在するのかを明らかにしていく予定である。