反応場の情報を統合した植物RISC形成機構の解明

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22J01347
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Rikkyo University
• Principal Investigator: 藤本 祐司 立教大学, 理学部, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2022-04-22 – 2025-03-31
• Keywords: processing body / RNAサイレンシング

Outline of Annual Research Achievements

2022年度開設の研究室のため、セットアップの作業を行なった。植物の生育、培養細胞の維持管理に問題がないことを確認した。また、シロイヌナズナのDCP1、SGS3のクローニングを行い、アグロインフィルトレーション法による一過的発現によりNicotiana benthamianaの葉において、GFPやmcherryなどの蛍光タンパク質を付加したこれらのタンパク質の局在が、先行研究や前所属における結果と変わりなく観察できることを確認した。SGS3については、N末端側に存在するプリオン様ドメインが局在に影響することが報告されているが、この局在変化についても同様に再現できることを合わせて確認した。SGS3については、全長タンパク質と共に、これらの変異体についてもFAPS法による解析に供試したいと考えている。split TurboID法に用いるTurboIDおよびその分割変異体についても作成を進めており、今後これらのN. benthamiana葉内における活性を確認する予定である。
SGS3に加えて、二次的siRNA生成に必要な因子であるAGO7、miR390、TAS3、SDE5、RDR6についてもN. benthamianaにおいて一過的に発現が可能であることを確認し、これらの因子の共発現によりtasiRNAがノーザンブロットで検出できる程度に蓄積することを確認した。今後はこれらの因子を共発現させた場合の局在の変化なども合わせて解析していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究室のセットアップ作業に伴い、大きな遅れが出ることが懸念されたが、そこまで大きな遅れは生じなかった。また、アグロインフィルトレーションの系が安定して運用できることがわかったのも収穫であった。活性の高い細胞抽出液を得るにはまだ至っておらず、この点の条件検討を重ねている。

Strategy for Future Research Activity

昨年度には植物の生育、培養細胞の維持管理に問題がないことを確認した。また、シロイヌナズナのDCP1、SGS3のクローニングを行い、アグロインフィルトレーション法による一過的発現によりNicotiana benthamianaの葉におけるこれらのタンパク質の局在が先行研究や前所属における結果と変わりなく観察できることを確認した。
今年度はDCP1をマーカーとしたprocessing bodyとSGS3をマーカーとしたsiRNA bodyを、FAPS法により抽出し、その構成因子や内部のRNA動態を解析したいと考えている。SGS3については、N末端側に存在するプリオン様ドメインが局在に影響することが報告されているが、この局在変化についても同様に再現できることを合わせて確認しており、これらの変異体についても同様に解析できると良いと考えている。split TurboID法に用いるTurboIDおよびその分割変異体についても作成を進めており、今後これらのN. benthamiana葉内における活性を確認する予定である 。
SGS3に加えて、二次的siRNA生成に必要な因子であるAGO7、miR390、TAS3、SDE5、RDR6についてもN. benthamianaにおいて一過的に発現が可能であることを確認し、これらの因子の共発現によりtasiRNAがノーザンブロットで検出できる程度に蓄積することを確認しており、今後はこれらの因子を共発現させた場合の局在の変化なども合わせて解析していく予定である。また、これらの因子の中でtasiRNAを蓄積させるために一過的な発現誘導の必要がない因子を探索し、より簡便なtasiRNA蓄積の解析系を構築したい。

Research Products

• [Presentation] ポテックスウイルスの3つの移行タンパク質の翻訳機構 (2023)
  • Author(s): 藤本祐司, 桂馬拓也, 橋本将典, 薦田(萩原)優香, 細江尚唯, 西田萩子, 二條貴通, 大島研郎, Jeanmarie Verchot, 難波成任, 山次康幸
  • Organizer: 令和5年度日本植物病理学会大会
• [Presentation] Short 5' untranslated region enables optimal translation of plant virus tricistronic RNA via leaky scanning (2022)
  • Author(s): 藤本祐司, 桂馬拓也, 橋本将典, 薦田(萩原)優香, 細江尚唯, 西田萩子, 二條貴通, 大島研郎, Jeanmarie Verchot, 難波成任, 山次康幸
  • Organizer: 第23回日本RNA学会年会 2022年7月21日