• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2022 Fiscal Year Research-status Report

フィロウイルス粒子形成機構の解明

Research Project

Project/Area Number 22KK0115
Research InstitutionNagasaki University

Principal Investigator

高松 由基  長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (00750407)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 野田 岳志  京都大学, 医生物学研究所, 教授 (00422410)
BALINGIT Jean・Claude・Palma  長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (40968723)
Project Period (FY) 2022-10-07 – 2026-03-31
Keywordsエボラウイルス / ヌクレオカプシド / ヌクレオカプシド様構造 / 微細構造解析 / 動態解析 / クライオ電子顕微鏡 / ライブセルイメージ顕微鏡 / BSL-4
Outline of Annual Research Achievements

エボラウイルスとマールブルグウイルスに代表されるフィロウイルスは、一類感染症に属しバイオセーフティレベル-4(BSL-4)に分類されるため、物理的な封じ込め設備及び機器が必要である。治療法は確立しておらず、重篤な出血熱症状と高い致死率を示す最も重要な新興感染症の一つである。そこで我々はドイツ国のBSL-4研究グループと共同して、フィロウイルスの形成機序(ヌクレオカプシド:NCの形成・輸送過程を含む)を分子レベルで解明することで、ウイルス複製阻害薬開発に貢献したいと考えた。本国際共同研究グループは、これまで10年以上にわたる共同研究の歴史があり、その中で、フィロウイルスの複製機序や構造解析に関わる先駆的な研究成果を輩出してきた。この研究を更に発展させるべく、本研究ではi) 前駆研究で構築したウイルスタンパク質複合体に対する高分解能顕微鏡解析、ii) ドイツ国のBSL-4施設で行う感染性ウイルス検体を用いた解析の二つのプロジェクトに取り組み、これまで解かれていないNCの形成機構を近原子分解能で解明することを目指す。
NCはウイルスRNA複製の足場であり、その構造を理解することは抗ウイルス薬開発に直接的に貢献することが期待される。これまで生化学的なアプローチで、単独タンパク質レベルおよび単独タンパク質間の相互作用に関する研究が進められてきた。一方でフィロウイルスNC複合体の構造解析については研究が進んでおらず、微細構造やタンパク質間相互作用については不明な点が多い。本研究では、本邦では行うことができないウイルス検体を用いた構造・分子機構解析に、構造解析・動態解析のスペシャリストが挑む。本邦でウイルス様粒子およびNC様構造を用いて、基礎情報を得るとともに実験条件を最適化し、ドイツ国でウイルス粒子を用いた構造解析に応用する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究代表者は前駆研究でEBOVのNCLS形成・輸送機構が、タンパク質発現系を用いた非感染性ライブセルイメージンングシステムで再現できることを示した。このシステムを用いてヌクレオカプシド様構造(NCLS)の形成・輸送は、3つのウイルスタンパク質で制御されることを解明した。またNCLSを構成する3つのウイルスタンパク質 (ヌクレオプロテインNP, VP24, VP35)について、どのドメインがNCの形成・輸送機能を制御するか解析した。これまでにVP24タンパク質のYxxLモチーフがNC形成・輸送に関わることを明らかにした。続いて、NP, VP35のNCLS形成・輸送制御領域の同定を進めた。NPは739個のアミノ酸から構成され、NP1-450がオリゴマー形成に重要であることから、タンパク質結合領域とされるC末領域の欠損変異体シリーズを構築した。同様にVP35についてもN末欠損変異体及びC末欠損変異体を作成し、NCLSの形成・輸送機能を評価した。
ヌクレオカプシドは、RNAのほかにNP, VP24, VP30, VP35, Lの5つのウイルスタンパク質で形成される。研究代表者の研究により、VP30はNCLS形成には関与しないが、NCLS周囲を取り囲むように局在すること、VP30-NP間相互作用によりVP30がNCLSに結合することが示唆された。従って、NCLS形成解析の際にVP30を加えることで、構造が安定する可能性が示唆された。
構造解析については、既報であったEBOVのNP-RNA構造に加えて、マールブルグウイルスのNP-RNA構造を近原子分解能で解明し報告した。またNP-NP結合領域およびNP-RNA結合領域を同定し、各ウイルスの転写・複製を制御するアミノ酸を同定した。
以上のように、構造解析・動態解析についてある程度の進捗を認めたため。

Strategy for Future Research Activity

本年度構築したNP変異体及びVP35変異体を用いて、細胞内で安定な最小限のNC様構造のオリエンテーションを決定する。また、それらの変異体を含むNC様構造およびウイルス様粒子(VLP)を微細構造解析に供するための精製作業を最適化する。これまで種々の密度勾配法を試したが、精製過程におけるロスが多く、最終産物の量が不十分であった。そこで地道にVLPを備蓄し、これまでの100倍量のスケールで精製作業を進める準備を進めた。これらのストック検体について、まずは小スケールで精製効率を確かめて、一番効率が良い手法を用いて、大規模な精製プロトコルを進める方針である。
また、構築した各変異体の転写・複製機能を評価するためにミニゲノムアッセイ法(レプリコンにレポーター遺伝子を導入することで転写・複製活性を評価する)で確かめる。さらにNCLSタンパク質の組み合わせについて、各タンパク質の細胞内局在を蛍光抗体法で、タンパク質間の相互作用を免疫沈降法で評価する。
国際共同研究としては、当研究室及び野田研究室で日程調整し渡独し、Becker研究室におけるウイルス検体を用いた共同研究を進める。具体的には、Becker研究室で申請者が構築した組換えウイルス(蛍光融合タンパク質発現ウイルスなど)を用いた解析などBSL-4実験施設を用いる研究計画について打ち合わせを行う。また次年度以降は、本邦で確立する密度勾配遠心分画法を用いたウイルスNCの精製を目指し、誰がいつBSL-4内でウイルス粒子を用いた実験を行うか研究計画を立案し共有する。これまでの研究ではウイルスを用いた検証はできていなかったため、本研究によりウイルス検体を用いて微細構造解析を進めることが期待される。

  • Research Products

    (24 results)

All 2023 2022

All Journal Article (8 results) (of which Peer Reviewed: 8 results,  Open Access: 5 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 7 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Co-Circulation of Dengue Virus Serotypes 1, 2, and 3 during the 2022 Dengue Outbreak in Nepal: A Cross-Sectional Study2023

    • Author(s)
      Rimal Sandesh、Shrestha Sabin、Pandey Kishor、Nguyen Thanh Vu、Bhandari Parmananda、Shah Yogendra、Acharya Dhiraj、Adhikari Nabaraj、Rijal Komal Raj、Ghimire Prakash、Takamatsu Yuki、Pandey Basu Dev、Fernandez Stefan、Morita Kouichi、Ngwe Tun Mya Myat、Dumre Shyam Prakash
    • Journal Title

      Viruses

      Volume: 15 Pages: 507~507

    • DOI

      10.3390/v15020507

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Differential Infectivity of Human Neural Cell Lines by a Dengue Virus Serotype-3 Genotype-III with a Distinct Nonstructural Protein 2A (NS2A) Amino Acid Substitution Isolated from the Cerebrospinal Fluid of a Dengue Encephalitis Patient2023

    • Author(s)
      Phu Ly Minh Huong、Nguyen Co Thach、Nguyen Thanh Vu、Ngan Nguyen Thanh Thi、Nabeshima Takeshi、Adungo Ferdinard、Takamatsu Yuki、Huy Nguyen Tien、Mai Le Thi Quynh、Morita Kouichi、Hasebe Futoshi、Moi Meng Ling
    • Journal Title

      Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology

      Volume: 2023 Pages: 1~11

    • DOI

      10.1155/2023/2635383

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] How an Outbreak of COVID-19 Circulated Widely in Nepal: A Chronological Analysis of the National Response to an Unprecedented Pandemic2022

    • Author(s)
      Pandey Basu Dev、Ngwe Tun Mya Myat、Pandey Kishor、Dumre Shyam Prakash、Nwe Khin Mya、Shah Yogendra、Culleton Richard、Takamatsu Yuki、Costello Anthony、Morita Kouichi
    • Journal Title

      Life

      Volume: 12 Pages: 1087~1087

    • DOI

      10.3390/life12071087

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Has COVID-19 suppressed dengue transmission in Nepal?2022

    • Author(s)
      Pandey Basu Dev、Ngwe Tun Mya Myat、Pandey Kishor、Dumre Shyam Prakash、Bhandari Pramananda、Pyakurel Uttam Raj、Pokhrel Nayanum、Dhimal Meghanath、Gyanwali Pardip、Culleton Richard、Takamatsu Yuki、Costello Anthony、Morita Kouichi
    • Journal Title

      Epidemiology and Infection

      Volume: 150 Pages: 1~4

    • DOI

      10.1017/S0950268822001790

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Neutralizing mAbs against SFTS Virus Gn Protein Show Strong Therapeutic Effects in an SFTS Animal Model2022

    • Author(s)
      Shimojima Masayuki、Sugimoto Satoko、Umekita Kunihiko、Onodera Taishi、Sano Kaori、Tani Hideki、Takamatsu Yuki、Yoshikawa Tomoki、Kurosu Takeshi、Suzuki Tadaki、Takahashi Yoshimasa、Ebihara Hideki、Saijo Masayuki
    • Journal Title

      Viruses

      Volume: 14 Pages: 1665~1665

    • DOI

      10.3390/v14081665

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Structural insight into Marburg virus nucleoprotein?RNA complex formation2022

    • Author(s)
      Fujita-Fujiharu Yoko、Sugita Yukihiko、Takamatsu Yuki、Houri Kazuya、Igarashi Manabu、Muramoto Yukiko、Nakano Masahiro、Tsunoda Yugo、Taniguchi Ichiro、Becker Stephan、Noda Takeshi
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 13 Pages: 1~9

    • DOI

      10.1038/s41467-022-28802-x

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Role of VP30 Phosphorylation in Ebola Virus Nucleocapsid Assembly and Transport2022

    • Author(s)
      Takamatsu Yuki、Yoshikawa Tomoki、Kurosu Takeshi、Fukushi Shuetsu、Nagata Noriyo、Shimojima Masayuki、Ebihara Hideki、Saijo Masayuki、Noda Takeshi
    • Journal Title

      Journal of Virology

      Volume: 96 Pages: 1~17

    • DOI

      10.1128/jvi.01083-22

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Filovirus helical nucleocapsid structures2022

    • Author(s)
      Hu Shangfan、Noda Takeshi
    • Journal Title

      Microscopy

      Volume: 00 Pages: 1~13

    • DOI

      10.1093/jmicro/dfac049

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Chikungunya virus infection in blood donors and patients during outbreak, Mandalay, Myanmar, 2019.2022

    • Author(s)
      Mya Myat Ngwe Tun, Aung Kyaw Kyaw, Takeshi Nabeshima, Khine Mya Nwe, shingo Inoue, Basu Dev Pandey, Yuki Takamatsu, Kyaw Zin Thant, Kouichi Morita.
    • Organizer
      第56回日本脳炎ウイルス生態学研究会
  • [Presentation] The Potential Role of Antigenic Variation in Driving the Dengue Virus Serotype 2 Genotype Shift in the Philippines in the Early 2000.2022

    • Author(s)
      Jean Claude Palma Balingit, Ryosuke Suzuki, Mark Pierre Dimamay, Ronald Matias, Filipinas Natividad, Corazon Buerano, Yuki Takamatsu, Meng Ling Moi, Kouichi Morita.
    • Organizer
      第56回日本脳炎ウイルス生態学研究会
  • [Presentation] Analysis of Dengue outbreak during the 2020 epidemic in Myanmar.2022

    • Author(s)
      Khine Mya Nwe, Mya Myat Ngwe Tun, Aung Kyaw Kyaw, Rina Iraha, Takeshi Nabeshima, Shingo Inoue, Basu Dev Pandey, Yuki Takamatsu, Kyaw Zin Thant, Kouichi Morita.
    • Organizer
      第56回日本脳炎ウイルス生態学研究会
  • [Presentation] ライブセルイメージングシステムを用いた高病原性ウイルス細胞内動態の解明2022

    • Author(s)
      髙松由基, 野田岳志, ベッカー ステファン
    • Organizer
      第63回日本熱帯医学会大会
  • [Presentation] Serological and molecular epidemiology of chikungunya virus infection in Vietnam, 2015 to 20192022

    • Author(s)
      Nguyen Thanh Vu, Ngwe Tun My Myat, Takamatsu Yuki, Moi Meng Ling, Le Thi Quynh Mai, Morita Kouichi, Hasebe Futoshi
    • Organizer
      第63回日本熱帯医学会大会
  • [Presentation] The Potential Role of Antigenic Variation in Driving the Dengue Virus Serotype 2 Genotype Shift in the Philippines in the Early 20002022

    • Author(s)
      Balingit Jean Claude, Ryosuke Suzuki, Dimamay Mark Pierre, Matias Ronald, Natividad Filipinas, Buerano Corazon, Yuki Takamatsu,Moi Meng Ling, Kouichi Morita
    • Organizer
      第63回日本熱帯医学会大会
  • [Presentation] Anti-SARS-CoV-2 activity of various PET-bottled Japanese green teas and tea compounds in vitro2022

    • Author(s)
      Ngwe Tun Mya Myat, Luvai Elizabeth, Nwe Khine Mya, Toume Kazufumi, Mizukami Shusaku, Takamatsu Yuki, Hirayama Kenji, Komatsu Katsuko, Morita Kouichi
    • Organizer
      第63回日本熱帯医学会大会
  • [Presentation] ウイルスタンパク質VP30に着目したフィロウイルス粒子形成機構の解明2022

    • Author(s)
      Yuki Takamatsu, Takeshi Noda, Becker Stephan
    • Organizer
      第69回日本ウイルス学会学術集会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] The discovery of herbal drugs and natural compounds as inhibitors of SARS-CoV-2 infection in vitro2022

    • Author(s)
      Mya Myat Ngwe Tun, Kazufumi Toume, Elizabeth Luvai, Khine Mya Nwe, Yuki Takamatsu, Shusaku Mizukami, Kenji Hirayama, Katsuko Komatsu, Kouichi Morita
    • Organizer
      第69回日本ウイルス学会学術集会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] The potential role of antigenic variation in driving the dengue virus serotype 2 genotype shift in the Philippines in the early 20002022

    • Author(s)
      Jean Claude Palma Balingit, Ryosuke Suzuki, Mark Pierre Dimamay, Ronald Matias, Filipinas Natividad, Corazon Buerano, Yuki Takamatsu, Meng Ling Moi, Kouichi Morita
    • Organizer
      第69回日本ウイルス学会学術集会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Seroprevalence of Chikungunya virus infection during its emergence in Myanmar2022

    • Author(s)
      Khine Mya Nwe, Mya Myat Ngwe Tun, Aung Kyaw Kyaw, Saw Wut Hmone, Yuki Takamatsu, Shingo Inoue, Kyaw Zin Thant, Kouichi Morita
    • Organizer
      第69回日本ウイルス学会学術集会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Serological and molecular epidemiology of chikungunya virus infection in Vietnam. 2015-2019.2022

    • Author(s)
      Vu Thanh Nguyen, Mya Myat Ngwe Tun, Yuki Takamatsu , Meng Ling Moi, Mai Thi Quynh Le, Kouichi Moirta , Futoshi Hasebe
    • Organizer
      第69回日本ウイルス学会学術集会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ライブセルイメージングによる高病原性ウイルス細胞内動態の解明2022

    • Author(s)
      髙松 由基
    • Organizer
      日本顕微鏡 学会第78回学術講演会
    • Invited
  • [Presentation] フィロウイルスヌクレオカプシドのアセンブル機構2022

    • Author(s)
      髙松由基, 野田岳志
    • Organizer
      九州微生物研究フォーラム
  • [Presentation] Structural basis of Marburg virus helical nucleoprotein-RNA complex formation.2022

    • Author(s)
      Yoko Fujita-Fujiharu, Yukihiko Sugita, Yuki Takamatsu, Kazuya Houri, Manabu Igarashi, Yukiko Muramoto, Masahiro Nakano, Yugo Tsunoda, Ichiro Taniguch, Stephan Becker, Takeshi Noda
    • Organizer
      17th International Symposium of The Institute Network, Kanazawa. October 14, 2022 (Poster)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Cryo-EM structure of the nucleoprotein-RNA complex of a novel filovirus, Lloviu virus.2022

    • Author(s)
      Shangfan Hu, Yoko Fujita-Fujiharu, Yukihiko Sugita, Lisa Wendt, Yukiko Muramoto, Masahiro Nakano, Thomas Hoenen, Takeshi Noda.
    • Organizer
      The 4th East-Asia Microscopy Conference, Taiwan.
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2023-12-25  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi