2012 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子破壊細胞を使った、化学物質の生物効果をハイスループットに解析するシステム
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23221005
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
武田 俊一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60188191)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣田 耕志 首都大学東京, 理工学研究科, 教授 (00342840)
山田 亮 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50301106)
岡田 徹也 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (70378529)
笹沼 博之 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00531691)
清水 宏泰 大阪医科大学, 医学部, 准教授 (60340551)
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| Project Period (FY) |
2011-05-31 – 2016-03-31
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| Keywords | 有害化学物質 / ハイスループットスクリーニング / 遺伝毒物学 / 発がん物質 / 変異原 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、（１）有害化学物質をハイスループットに同定するバイオアッセイを樹立することと、（２）変異原性（発がん性）の作用機序を分子レベルで解明することにある。
（１）有害化学物質を同定するバイオアッセイを樹立：米国立医学保健研究所（NIH）に研究員を派遣してプロジェクトを進めている。
（２）変異原性の作用機序解析
（２－１）染色体検査で見つかる断裂の作用機序解析：化学物質の変異原性を証明するのに、化学物質で曝露した細胞の分裂期染色体を観察することが広く使われる。この手法を染色体検査と呼ぶ。我々は、染色体検査で見つかる断裂が、DNA２重鎖切断が原因でない場合があることを証明した（Fujita, M. et al., PLoS One, 2013）。抗がん治療薬、5-FUは染色体断裂を起こす（すなわち変異原性がある）が故に、X放射線のようにDNA２重鎖切断を誘導することによってがん細胞を殺すと考えられてきた。その考えは、我々の研究によって、誤っていることが解明できた。
（２－２）Mus81とXPFの機能重複：Mus81とXPFとの２重欠損細胞を作製することによって、両方のDNA切断酵素が相同組換えの後期に機能し、かつ互いに相補性があることが証明できた。DNA損傷するタイプの抗がん治療（放射線、シスプラチン、トポデカン等）のうち、特にシスプラチンによって生じたDNA損傷を修復する場合に、両方のDNA切断酵素は相補し合いながらDNA修復する（Kikuchi, K. et al., Cancer Res., 2013）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）有害化学物質を同定するバイオアッセイを樹立
我々は、既に変異原性をハイスループットに同定するバイオアッセイを樹立した。その妥当性を検証する目的で、米国立医学保健研究所（NIH）に派遣した。NIHには、妥当性を検証する目的で創られた1,800種類（フェーズ１）と11,000種類（フェーズ２）のゴールデンスタンダード化学物質ライブラリー（その生物効果が詳細に解っている化学物質から成る）を持っている（同様のものが国内にはない）。我々のバイオアッセイを使ってフェーズ１ライブラリーを解析する作業が2011年に終わった。米国のNational Toxicology Programがフェーズ２ライブラリーを樹立する作業が当初の予定より１年近く伸びたので、その分、本研究の進展が遅れた。
（２）変異原性の作用機序解析
（２－１）SILAC (Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture)法をニワトリDT40細胞株の為に最適化：DNA損傷が不正確に修復される結果、変異が発生する。この分子機構を解明するのにプロテオーム解析、とくにSILACのような次世代プロテオーム解析は必須である。プロテオーム解析の感度を上げる目的で、DT40細胞のトランスクリプトームを工樂博士（神戸・理化学研究所）と共同して2012年度に解析した。このデータベースによって、ニワトリの系統間にあるゲノム配列の多型性を気にすることなく、質量分析のデータからタンパク分子を同定する作業ができるようになった。
（２－２）PARP DNA修復酵素を阻害する抗がん治療薬の作用機序解析：米国に派遣していた村井助教（2012年１０月着任）が論文発表した（Murai, J. et al., Cancer Res., 2013）。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）有害化学物質を同定するバイオアッセイを樹立：フェーズ１ライブラリーの実験結果が良好であったので、NIHに研究員を派遣して、昨年末からフェーズ２ライブラリーを解析する作業を開始している。
（２）変異原性の作用機序解析
（２－１）SILAC (Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture)法をニワトリDT40細胞株の為に最適化：DNA損傷が不正確に修復される結果、変異が発生する。この分子機構を解明するのにプロテオーム解析、とくにSILACのような次世代プロテオーム解析は必須である。プロテオーム解析の感度を上げる目的で、DT40細胞のトランスクリプトームを工樂博士（神戸・理化学研究所）と共同して2012年度に解析した。このデータベースによって、ニワトリの系統間にあるゲノム配列の多型性を気にすることなく、質量分析のデータからタンパク分子を同定する作業ができるようになった。
（２－２）SILACによる、DNA損傷発生後のユビキトームおよびフォスプォトーム解析：DNA損傷が発生すると、様々なキナーゼとユビキチン化酵素とが活性化される。これらの酵素は互いに重複した機能を持つ場合が多い。我々は、この重複した機能を解析する目的で、複数種類のキナーゼ（例、ATMとATR）や複数種類のユビキチン化酵素（例、RNF8とRNF168）の多重遺伝子破壊を系統的に作製している。様々なDNA損傷誘導処理（例、X放射線やシスプラチン）の前後や、野生型と遺伝子破壊細胞のあいだで、ユビキトームおよびフォスプォトームをSILACを使って解析することを2013年度から開始する。この実験により各酵素（キナーゼとユビキチン化酵素）の基質を網羅的に同定できる。
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