2014 Fiscal Year Annual Research Report
炭素ー窒素結合切断および合成酵素群の統括的機能解明と応用開発
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23228002
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
小林 達彦 筑波大学, 生命環境系, 教授 (70221976)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
熊野 匠人 筑波大学, 生命環境系, 助教 (70585025)
橋本 義輝 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (00323254)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 微生物 / 酵素 / 代謝 / 精製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炭素-窒素結合分解・合成酵素群の中で、（他の酵素に関しては継続して研究を進めているが）現在、細胞壁合成に関わる酵素による有用物質生産、およびニトリルヒドラターゼとは異なるタイプのニトリル水和酵素に関して得られている成果について以下に記載する。
グラム陽性菌細胞壁のテイコ酸のD-アラニル化に関わる初発酵素はチオエステル結合形成反応を触媒するが、本酵素がペプチド(C-N)結合形成能も示すことを発見していた。
そこで、D-アラニンを様々なL-システイン類似化合物と反応させ、反応の進行が認められた場合には反応産物の分離および同定を行った。アミノ基もチオール基ももたないシステイン類似化合物、あるいはアミノ基はもつがチオール基をもたないシステイン類似化合物の時には、いずれも反応は進行せず、一方、アミノ基をもたずにチオール基のみをもつ類似化合物の時には産物がチオエステル結合化合物と同定した。チオール基および一部保護されたアミノ基をもつシステイン類似化合物の時には、チオエステル結合化合物、アミド化合物の順で産物が検出された。これらの結果を基に、本来の酵素反応によりS-アシルL-システインが中間体として合成され、続く化学的なS→Nアシルシフト反応によりN-アシルL-システインが合成されることによってペプチド(C-N)結合が形成されることを実証し、新規な酵素-化学カップリング連続反応機構として提唱した。
ニトリルヒドラターゼとは異なるタイプのニトリル水和酵素についても検討を行った。本ニトリル水和酵素の発現プラスミドを構築し、大腸菌を宿主として大量発現系を構築した。各種クロマトグラフィーにより精製を行い、精製標品を用いて本酵素の物理化学的諸性質の一部を解明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本来はチオエステル結合形成反応を触媒する酵素（グラム陽性菌細胞壁のテイコ酸のD-アラニル化に関わる酵素）がペプチド(C-N)結合形成能も示すことを発見していたが、今年度は、その触媒反応機構について詳細に解析することでユニークな反応機構を解明することに成功し、これまでに報告例のない酵素法による新たなペプチド合成法として提案した。
ニトリルヒドラターゼとは異なるタイプのニトリル水和酵素についても、本酵素の大量発現系および精製方法を確立し、本酵素の諸性質を一部解明した。
さらに、炭素-窒素結合合成酵素において、本来の基質アルドキシムに作用する脱水反応とは異なり、過酸化水素に作用する活性を見いだすことにも成功し、おおむね順調に進展している
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| Strategy for Future Research Activity |
ニトリル前駆体アナログ代謝能を持つ微生物については、決定した最適な培養条件で培養した菌体からニトリル前駆体アナログ分解酵素を単離精製し諸性質を解明するとともに、本酵素遺伝子のクローニングを行う予定である。
既存のC-N結合切断酵素や、大量精製が可能となった新規C-N結合切断酵素については、引き続き、結晶化・X線構造解析によって３次元構造を解明する。立体構造から得られる情報等を基に、活性中心と予想されるアミノ酸残基に対して部位特異的変異法により変異酵素を作成し、活性測定等を行うことで活性アミノ酸残基を同定する。
さらに、炭素-窒素結合合成酵素が触媒する本来の反応とは、異なる反応についても詳細を明らかにする。
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[Journal Article] Peptide Bond Synthesis by a Mechanism Involving an Enzymatic Reaction and a Subsequent Chemical Reaction2016
Author(s)
Abe, T., Hashimoto, Y., Zhuang, Y., Ge, Y., Kumano, T., & Kobayashi, M.
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Journal Title
J. Biol. Chem.,
Volume: 291
Pages: 1735-1750
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] ニトリル合成酵素の多機能性2015
Author(s)
山田 優駿、橋本 義輝、熊野 匠人、小林 達彦
Organizer
2015年度日本農芸化学会大会
Place of Presentation
岡山県岡山市、岡山大学
Year and Date
2015-03-29 – 2015-03-29
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