2012 Fiscal Year Research-status Report

Ｇｑ蛋白質共役型受容体の細胞内選別輸送機構に関する研究

Research Project

Project/Area Number	23590119
Research Institution	Meiji Pharmaceutical University
Principal Investigator	菱沼滋明治薬科大学, 薬学部, 准教授 (70211505)
Keywords	G蛋白質共役型受容体 / ヒスタミンH1受容体 / Internalization / Down-regulation / クラスリン / カベオラ / リソソーム / プロテアソーム
Research Abstract	Gq蛋白質共役型ヒスタミンH1受容体（H1R）は、中枢から末梢に至るまで広範囲に分布し、覚醒レベル調節や即時型アレルギーなどの各種生理・病態に深く関与している。しかしながら、受容体刺激に伴うH1Rの細胞内Trafficking機構に関する研究は、ほとんど進んでいない。一般に、G蛋白質共役型受容体（GPCR）の細胞内Traffickingにおいて、アレスチンは、GPCRの細胞内C末端に結合することによって、クラスリン被覆小胞の形成に関与するとされる。ここで、H1Rの細胞内C末端は、他のGPCRに比べて極端に短く（17アミノ酸残基）、また、可視化を目的にH1Rの細胞内C末端をGFPで標識したH1Rは、野生型H1Rと異なり、脂質ラフト／カベオラを介した機構によって細胞内に輸送される（Self et al., Br. J. Pharmacol., 146, 612, 2005; Hishinuma et al., J. Neurochem., 113, 990, 2010）。従って、H1受容体のC末端に対するアレスチンの結合親和性が、H1Rの細胞内輸送におけるクラスリン／カベオラ選別輸送に関与する可能性が高いと考えられるが、受容体可視化の目的で細胞内C末端を修飾することは、H1Rの真の細胞内Trafficking機構の解明には不適当と考えられる。そこで、当該年度は、まず、H1Rの細胞外N末端にHAタグをつけた変異H1R（HA-H1R）を作成し、その細胞内Trafficking機構を解析した。その結果、HA-H1Rは、野生型H1Rと同様に、脂質ラフト／カベオラ経路ではなく、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されることが明らかとなった。現在、H1Rの細胞内輸送におけるクラスリン／カベオラ選別機構の詳細を解明する目的で、HA-H1Rの細胞内C末端側の変異受容体を作製中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該研究は、 (1) H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構 (2) H1受容体のDown-regulationにおけるプロテアソーム／リソソーム選別機構（プロテインキナーゼC／ユビキチン／プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulation及びCaM キナーゼII／リソソーム経路を介した遅発型Down-regulation）の解析により、個々の受容体に備えられた細胞内選別輸送機構の詳細を分子レベルで明らかにすることを目的としている。昨年度（初年度）は、プロテインキナーゼC／ユビキチン／プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulation機構として、第3細胞内ループSer398が関与する可能性を明らかにできたことから、目的の達成に向けて好発進できたと考えている。今年度は、H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構解明の第一歩として、細胞外N末端にHAタグをつけた変異H1受容体（HA-H1R）を作成し、その細胞内Trafficking機構を解析した。その結果、HA-H1Rは、野生型H1Rと同様にクラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されることが明らかとなり、今後、HA-H1Rの細胞内C末端側の変異受容体を用いた解析により、H1受容体の細胞内輸送におけるクラスリン／カベオラ選別機構の詳細が明らかになるものと期待される。
Strategy for Future Research Activity	(1) H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構 H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構として、H1受容体の細胞内C末端が関与する可能性を明らかにする目的で、細胞内C末端を変異させたH1受容体を用いて解析し、クラスリン経路を介したH1受容体の細胞内輸送がカベオラ経路に変換されるメカニズムを解明する。 (2) H1受容体のDown-regulationにおけるプロテアソーム／リソソーム選別機構昨年度の研究から、プロテインキナーゼC／ユビキチン／プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulationには、第3細胞内ループSer398が関与する可能性が明らかとなったことから、今後は、CaM キナーゼII／リソソーム経路を介した遅発型Down-regulationに第2細胞内ループ（Thr140・Thr142）が関与する可能性を明らかにする。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	本実験系では、培養細胞を用い、放射性リガンドによる受容体結合実験、抗体を用いた免疫組織染色などを行う。従って、試薬類として、受容体に対する放射性リガンド、各種抗体、細胞培養用試薬、また、器具類として、培養フラスコなどが必要となる。交付予定額（直接経費：1,000千円、間接経費：300千円）は、当初の計画通り、放射性リガンド（[3H]pyrilamine：100千円/9.25 MBq×2本＝200千円）、抗体（抗HA抗体など：50千円/1本×4本＝200千円）、牛胎児血清（30千円/1本×10本＝300千円）、培養フラスコ（30千円/1箱×10箱＝300千円）、培養ウェル（30千円/1箱×10箱＝300千円）などに使用する予定である。