2013 Fiscal Year Research-status Report
Ｇｑ蛋白質共役型受容体の細胞内選別輸送機構に関する研究
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23590119
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
菱沼 滋 明治薬科大学, 薬学部, 准教授 (70211505)
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| Keywords | ヒスタミンH1受容体 / G蛋白質共役型受容体 / Internalization / Down-regulation / クラスリン / リソソーム / ユビキチン / プロテアソーム |
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| Research Abstract |
アゴニスト刺激に伴うG蛋白質共役型受容体（GPCR）の細胞内輸送には、G蛋白質共役型受容体キナーゼ/アレスチン/クラスリンを介した小胞輸送経路が関与することが知られている。一般に、GPCRの細胞内輸送において、アレスチンは、GPCRの細胞内第3ループ/C末端に結合することによって、クラスリン被覆小胞の形成に関与するとされる。ここで、ヒスタミンH1受容体（H1R）の細胞内C末端は、他のGPCRに比べて極端に短く、また、可視化を目的にH1Rの細胞内C末端をGFPで標識したH1Rは、野生型H1Rと異なり、脂質ラフト／カベオラを介した機構によって細胞内に輸送されることが知られている（Self et al., Br. J. Pharmacol., 146, 612, 2005; Hishinuma et al., J. Neurochem., 113, 990, 2010）。当該研究では、昨年度までに、H1Rの細胞外N末端をHAタグで標識した変異H1R（HA-H1R）を作成し、その細胞内輸送機構を解析した。その結果、HA-H1Rは、野生型H1Rと同様に、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されることが明らかとなった。そこで、今年度は、H1Rの細胞内輸送におけるC末端の役割を明らかにする目的で、HA-H1Rの細胞内C末端変異受容体3種（HA-T478A、HA-S487A、HA-S487trancation）を作製して解析した。その結果、HA-T478A及びHA-S487Aは、野生型H1Rと同様に、アゴニスト刺激に伴いクラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されること、一方、C末端1残基を切断したH1R（HA-S487trancation）では、細胞内輸送が阻害されることを見出した。従って、H1Rの細胞内C末端は、細胞内輸送に極めて重要な役割を果たしていると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究では、(1)H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構及び(2) H1受容体のDown-regulationにおけるプロテアソーム／リソソーム選別機構（プロテインキナーゼC／ユビキチン／プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulation及びCaM キナーゼII／リソソーム経路を介した遅発型Down-regulation）の解析により、個々の受容体に備えられた細胞内選別輸送機構の詳細を分子レベルで明らかにすることを目的としている。
初年度は、プロテインキナーゼC／ユビキチン／プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulation機構として、第3細胞内ループS398が関与する可能性を明らかにした。次年度は、H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構解明の第一歩として、細胞外N末端にHAタグをつけた変異H1受容体（HA-H1R）を作成し、HA-H1Rは、野生型H1Rと同様にクラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されることを確認した。今年度は、HA-H1Rの細胞内C末端の変異受容体を用いて解析した。その結果、C末端のアミノ酸1残基の欠如により、細胞内移行が阻害されることを見出し、H1受容体の細胞内輸送におけるC末端の重要性を明らかにした。今後、さらにC末端を修飾した受容体を作成して解析することにより、H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構の詳細が明らかになるものと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン／カベオラ選別機構
H1受容体のInternalizationに、H1受容体の細胞内C末端が関与することが明らかとなったことから、H1受容体の細胞内C末端をさらに修飾・改変した変異H1受容体を用いて解析することにより、クラスリン経路を介したH1受容体の細胞内輸送がカベオラ経路に変換されるメカニズムを解明する。
(2) H1受容体のDown-regulationにおけるプロテアソーム／リソソーム選別機構
プロテインキナーゼC／ユビキチン／プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulationには、第3細胞内ループS398が関与する可能性が明らかとなったことから、今後は、CaM キナーゼII／リソソーム経路を介した遅発型Down-regulationに第2細胞内ループ（T140・T142）が関与する可能性を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
年度末に預金利息がついたため。
次年度に、物品費として使用する。
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