2013 Fiscal Year Annual Research Report
血栓標的ドメインとヘビ毒由来フィブリン分解酵素融合体による血栓溶解剤の開発
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23590199
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| Research Institution | Teikyo Heisei University |
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Principal Investigator |
石田 功 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (00415556)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池本 守 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (90311331)
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| Keywords | 血栓溶解剤 / フィブリン分解活性 / 遺伝子組み換えタンパク質 |
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| Research Abstract |
臨床試験でドロップした血栓溶解剤(Alfimeprase=A)をリバイバルさせる技術を開発することを目標とした。Aは直接フィブリンを分解する活性を持ち、tPA(Activase)と異なりプラスミン産生がないため、2次的な補体系活性化が起きない。Aは血中のα-2マクログロブリン(α-2M)と速やかに複合体を形成して、活性が阻害されるため、臨床第2相でドロップした。
【方法】ガラガラ蛇由来A、ハブ毒由来HR2aはα-2Mと複合体を形成するが、構造が似ているHR1aのN末ドメインは複合体を形成しないことから、HR1aのC末ドメイン（コラーゲン結合領域）がα-2Mとの結合を阻止できる可能性を考え、AにHR1aのC末ドメインを結合させた融合体(AH)を作製した。フィブリンへの標的化を考慮して、更にヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン１を融合させたAHP遺伝子を化学合成した。上記遺伝子を大腸菌発現系(pE-SUMO)に挿入して、発現・生産を行い、HisTrapカラムで精製した。精製タンパク質の生物活性はフィブリノゲンの切断活性とヒト血餅溶解活性で見た。
【結果と考察】フィブリン分解活性を持つ遺伝子組換えA、AH、AHPタンパク質の生産に成功した。N末端にSUMOペプチドを付加したSUMO-AHPは特に血栓溶解活性が強かった。AHPはフィブリンに結合するためと考えられた。ハブ毒由来HR1aのC末タンパク質を融合させたSUMO-AHPにおいても、フィブリノゲン切断活性、ヒト血餅溶解活性のα-2Mによる阻害を回避することはできなかった。ハブ毒のHR1aのAlfimeprase相同部分はα-2Mと結合しないのであって、C末部分HR1Cのコラーゲン結合ドメインを持っているためではないと結論された。Fibrin消化活性があってかつα-2Mに結合しないヘビ毒由来タンパク質を見出すことが必要である。
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