新鮮及び凍結卵巣由来の未熟卵の無血清培地による体外培養法確立を目指した基礎的検討

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23592427
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 小森 慎二 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (60195865)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 澤井 英明 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (80215904)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: 体外培養 / 未熟卵 / 無血清培地

Research Abstract

マウス未熟卵によるART用の代替血清を添加した培養液を用いて、未発育卵胞の発育誘導が可能か否か検討した。材料として6日齢のBDF1マウスを使用した。未発育卵胞は、直径により3グループ (A群 : 80-95&#61549;m, B群 : 70-80&#61549;m, C群 : 60-70&#61549;m) に分けた。A、B群は、主に2-3層の顆粒膜細胞に覆われた卵母細胞からなる初期2次卵胞に相当し、C群は、主に1層の顆粒膜細胞に覆われた1次卵胞に相当するものであった。発育培養 (In vitro growth ; IVG) にはコラーゲンゲル包埋法を用いた。培養液にはrec-FSH、ITSを含むα-MEMに、ART用ヒト代替血清Serum Protein Substitute (SPS , SAGE In-Vitro Fertilization, Inc. ) またはFBSを5%の濃度で添加した。1日おきに半量の培養液を交換しながら、37℃、5%CO2-5%O2-90%N2の条件で培養した。9日間培養した後、コラゲナーゼ処理により発育した卵胞を遊離させ、卵母細胞を覆った状態で顆粒膜細胞が増殖した卵胞を発育卵胞と判定した。その結果、9日間のIVGによるマウス卵胞の発育率は、A群では、SPS : 87.8% (65/74), FBS : 86.0% (49/57)であり、培養液による発育率に差は認めなかった。一方、B群の卵胞発育率は、SPS : 85.3% (93/109), FBS : 49.4% (38/77)であり、C群の卵胞発育率は、SPS : 62.2% (51/82), FBS : 16.3% (8/49)であった。卵胞径の小さいB、C群で、SPS実験区がFBS実験区と比べて著明に高い発育率を示した(P<0.01 : χ2-test)。現在さらに検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では無血清培地での未熟卵の体外培養系の確立を目的としている。現在は、まだマウスの未熟卵の培養系を用いた研究を行っている。現在までのところ卵のある程度の発育に有効な培地を同定してきた。しかし、その後の発育により良い培地の検討は現在進行中である。これがある程度確立すれば、ヒト未熟卵への応用をさらに検討することができると考えている。現時点での達成率は３０％程度と考えている。今後は、未熟卵の第2培養法の確立をめざした研究が中心となる。材料としては、マウスの未熟卵を用いて継続して検討を行っていく。

Strategy for Future Research Activity

現在実施しているマウスでの未熟卵での培養系（IVG-1,IVG-2)を基礎として、様々な培養条件を検討していく予定である。また、それぞれの培養過程での遺伝子発現についても適宜検討をおこない、それぞれの培養条件における遺伝子レベルでの検討も合わせて行う予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

未熟卵の培養系を用いた研究を中心に行うため、培地など体外培養に必要な試薬などの消耗品を中心に研究費を使用する。さらに様々な培養条件での遺伝子発現の検討も行うのでそれに必要は解析キットや遺伝子合成、遺伝子解析など必要な消耗品に研究費を使用する予定である。