2011 Fiscal Year Research-status Report
１発の活動電位発生により細胞死に至る細胞の作製と新規創薬スクリーニング系の開発
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23659046
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
今泉 祐治 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (60117794)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大矢 進 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (70275147)
山村 寿男 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 講師 (80398362)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 活動電位 / ナトリウムチャネル / 細胞死 / イオンチャネル標的創薬 / 高効率探索系 |
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| Research Abstract |
活動電位を発生する興奮性細胞において、電位依存性Na+チャネルは活動電位という高速シグナルの担い手分子であり、活性化に続く極めて速やかな不活性化がその分子機能を可能にしている。一方、電位依存性Na+チャネルが過剰に活性化されると様々な疾患をもたらす。遺伝子異常を含む何らかの原因による不活性化の遅延は、特定のてんかんや不整脈など極めて重篤な疾患をもたらす。トリカブト毒成分のアコニチンなど数種の低分子化合物は、Na+チャネル不活性化を遅延させ、活動電位幅延長を引き起こすことにより毒性を発揮する。そのため電位依存性Na+チャネルの不活性化機構は詳細に研究され、不活性化を担う複数部位のアミノ酸群が同定され、それらのアミノ酸を遺伝子点変異により置換すると不活性化が遅延され、そのような変異Na+チャネル発現細胞は死に易いことが明らかとなっている。 本研究の目的は、不活性化遅延性の変異型Na+チャネルを定常発現した細胞を作成し、これを用いて過剰なNa+流入による細胞内Na+貯留の定量的解析やそれによる細胞障害発生機構の解明を行うことである。さらに1発の活動電位発生で細胞死に至るその細胞系をイオンチャネル標的創薬の高効率スクリーニングシステムへ応用することである。不活性化の遅い遺伝子変異を導入したNa+チャネル（変異Nav1.5）と深い静止膜電位を保持するための内向き整流性K+チャネル（Kir2.1）を同時にHEK293細胞に定常発現させた試験細胞を作成し、電気刺激により持続性活動電位が発生し、１発の活動電位により短時間（5分以内）で細胞死に至ることを見出した。さらに薬物誘発性不整脈の安全性試験に不可欠なhERG K+チャネルをさらに共発現することにより、新たな薬物の安全性試験用スクリーニングシステムとして実用可能であることを示した（J Biomolec Scr, 2012）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
変異型Na+チャネルとKir2.1を定常発現したHEK293細胞（試験細胞）を作成し、電気刺激により１発の活動電位が発生することにより、活動電位が１分以上も継続し、５分以内に確実に細胞死が生じることを明らかにしたまたhERG K+チャネルを基本細胞に定常発現させた細胞の作成を23年度に達成した。この細胞を利用してhERG K+ チャネル阻害による薬物の催不整脈作用のスクリーニングが可能であることを示した（J Biomolec Scr, 2012）。本来、これは平成24年度に実施する予定であったが、前倒しした。さらに5-HT3受容体などの受容体刺激により脱分極を引き起こすイオンチャネル型受容体遺伝子を、試験細胞に加えて発現させることにより、受容体作用薬や拮抗薬の探索系の構築の可能性を示した（投稿準備中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
変異型Na+チャネルとKir2.1を定常発現させた試験細胞に5-HT3受容体を加えて発現させた細胞系を利用することにより、5-HT3受容体作用薬や拮抗薬の探索系を確立する。同様にニコチン受容体を発現させた系を開発し、この「１発の活動電位発生により細胞死が生じる系」を用いる化合物探索法の一般性と有用性を示す。急速に細胞内Na+濃度が上昇した場合に生じる細胞死の機序について、細胞内Na+濃度とCa2+濃度の持続性活動電位中の変化を観測することになどにより解明する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
各種イオンチャネル遺伝子を定常発現させたHEK293細胞の作成に必要なベクター、遺伝子導入用試薬、抗生物質、細胞培養用試薬などを購入する。細胞内Na+やCa2+濃度を測定するための各イオン感受性蛍光色素や各種薬物などの化合物を購入する。
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[Journal Article] TRIC-A channels in vascular smooth muscle contribute to blood pressure maintenance2011
Author(s)
Yamazaki D, Tabara Y, Kita S, Hanada H, Komazaki S, Naitou D, Mishima A, Nishi M, Yamamura H, Yamamoto S, Kakizawa S, Miyachi H, Yamamoto S, Miyata T, Kawano Y, Kamide K, Ogihara T, Hata A, Umemura S, Soma M, Takahashi N, Imaizumi Y, Miki T, Iwamoto T, Ta
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Journal Title
Cell Metab
Volume: 14(2)
Pages: 231-41
DOI
Peer Reviewed
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