2011 Fiscal Year Research-status Report
グロボ系スフィンゴ糖脂質のＬＰＳ受容体への特異的結合による生体防御機構
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23659171
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
古川 鋼一 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80211530)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | LPS / 糖脂質 / エンドトキシン / 脂質ラフト / ミクロドメイン / シグナル / グロボシド / 血管内皮 |
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| Research Abstract |
グロボ系糖脂質の、LPS毒性の抑制およびLPS刺激によるシグナルの制御機能を解析するために、グロボ系糖脂質を欠損するGb3/CD77合成酵素（A4galt）のKOマウスおよびそれらに由来する血管内皮初代培養細胞を用いた検討を行った。とくに、LPS受容体、TLR4-MD-2複合体に対するグロボシドの結合特異性について検討を行い、A4galt 欠損マウスと野生型マウス間の、LPSへの感受性の差異のメカニズムを明らかにした。具体的には、 LPS刺激に対する生体反応でのグロボ系糖脂質の役割を解析するために、グロボ系糖脂質欠損A4galのKOマウス由来血管内皮初代培養細胞を用いて、LPS刺激時のシグナル変化と遺伝子発現を比較検討した。その結果、iNOS、TNAa、IL-6、NO等の発現レベルが亢進することが判明した。さらに、血管内皮初代培養細胞へGb3合成酵素遺伝子の再導入時に、反応性の回復が確認された。また、LPS注入マウスのLPS感受性を、A4galt 欠損マウスと野生型で比較し、KOマウスでの感受性亢進を認めた。 次に、糖脂質のLPS受容体複合体への結合の検討のため、初代培養血管内皮細胞の糖鎖改変によるLPSの結合実験とTLR-4/MD2に対する糖脂質の結合実験を行った。そのために、His-MD-2と糖脂質の複合体の共沈降、およびNative-PAGEを行った。さらに種々の糖脂質を用いた結合阻害を行い、結合特異性を明らかにした。これらの結果をふまえて、TLR-4/MD2に対する糖脂質の結合機構を明らかにするために、複合体のドッキングモデルを構築して、セラミド部分のみならずGb4の４糖部分がMD2の疎水性ギャップにはまり込んで結合することが示された。さらに、Gb4とTLR4-MD2複合体との細胞膜上での会合状態を、細胞免疫染色と超遠心による脂質ラフト分離により観察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、周到な準備と予備実験が実施されてきており、多くの場合、基礎実験を繰り返すことなく、有意の実験結果を導くことが可能であった。また、レトロウイルス発現ベクターによるGb3合成酵素cDNAの導入や、複合体のドッキングモデル作成による解析、さらにnative PAGEに関しては、各々の領域の専門家の意見をもらい、時には協力を得ながら進めた結果、順調に進展することが可能となった。一方、これまで、努力目標としてきた、Gb4とTLR-MD2との複合体の結晶解析に関しては、結合力の弱さが主な原因となって、結晶の作成がやや遅れているのが現状である。
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| Strategy for Future Research Activity |
おもに、活性化、病理組織変化などの比較検討を行い、KOマウスと野生型マウスにおけるLPS感受性の差異を、具体的な病理変化とMAPKファミリー、サイトカイン、転写因子等の発現解析により検討する。 さらに、グロボ系糖脂質の脂質ドメイン(長さと飽和度)の影響について、比較解析を行う。また、糖脂質単分子とクラスターの比較解析、およびTLR-4/MD2に対する糖脂質の結合のイメージング解析を行うため、細胞膜分子に対する蛍光標識抗体により経時観察する。 グロボ系糖脂質とMD2との細胞内カップリングの可能性につき、融合タンパク質MD-2と糖脂質との細胞内会合の有無を、pull-down 実験や抗体染色により検討する。また、膜上でのGb4と相互作用する分子のさらなる同定のために、EMARS（Enzyme-Mediated Activation of Radical Sources）反応を行い、グロボ系糖脂質会合新規分子の同定を試みる。 最終的に、臨床応用に向けたグロボ系糖脂質の機能の検証を行う。すなわち、種々の糖脂質の前投与によって、注入LPSの毒性がどの程度軽減されるかを、投与量、投与経路、などの条件を変えて比較検討する。さらにLPS注入後の種々の時間帯における糖脂質投与の効果の有無と程度につき比較検討し、発症後における治療効果の可能性につき検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
多くは、上に掲げた諸実験を遂行するための物品（消耗品）の購入に充てる。また、研究打ち合わせ用の若干の交通費、さらに研究成果発表のための、ジャーナル投稿代などに使用する予定である。
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[Journal Article] C9-R95X Polymorphism in Patients with Neovascular Age-Related Macular Degeneration.2011
Author(s)
Nishiguchi KM, Yasuma TR, Tomida D, Nakamura M, Ishikawa K, Kikuchi M, Ohmi Y, Niwa T, Hamajima N, Furukawa K, Terasaki H
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Journal Title
Invest Ophthalmol Vis Sci.
Volume: 53(1)
Pages: 508-12
DOI
Peer Reviewed
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