マウス大脳皮質形成において皮質深部で発現するリーリン蛋白質の機能解析

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23700384
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 廣田 ゆき 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (00453548)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: 大脳皮質 / 6層構造 / ニューロン / リーリン

Research Abstract

本年度はリーリン蛋白質の皮質深部における発現と機能の解析のために下記の研究を行った。1. リーリンの発現パターンの解析：リーリンの発現時期、消失時期を明らかにするために、新規の抗体を用いて脳切片を発生段階を追って免疫化学手法により解析した。その結果、中間体を移動する介在ニューロンの一部にリーリンが発現されることが明らかになった。2. 初代培養を用いた解析：中間帯で発現するリーリン蛋白質の機能をin vitroで検討するために、胎生期脳室帯の細胞を単離し、初代培養を行った。まず培養下で新生ニューロンが生体内と同様の挙動を示す条件を決定するために、培養密度、培養時間を検討し、脳室帯でラベルされたニューロンが多極性および双極性の形態を示す培養系を確立した。さらにリーリン受容体であるApoER2のノックダウンを行い、双極性ニューロンの存在率が増加することを明らかにした。このことからリーリンシグナルが脳室帯付近でのニューロンの正常な移動に必要であることが示唆された。3. 生体内でのリーリンシグナルの機能を調べるために、胎生期１４日の脳においてApoER2のノックダウン実験を行い、４８時間後に細胞の分布と形態を解析した。この結果、通常は脳室帯から離脱したニューロンは長時間脳室下帯に蓄積するが、ApoER2を阻害するとこの蓄積が減少した。また細胞極性にも変化が見られた。これらの結果から、脳室下帯におけるニューロンの極性と移動の制御にリーリンシグナルが関与することが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、皮質形成過程において移動を開始したニューロンに対するリーリン蛋白質の作用機序を明らかにし、層形成初期の分子メカニズムを明らかにすることを目的として研究を行っている。本年度はリーリンタンパク質の脳室下帯における発現と、リーリン受容体の機能阻害の影響を明らかにすることが出来た。このことは、今までリーリンシグナルが脳表面に発現される高濃度のリーリンタンパク質によって説明されてきた背景に新しい視点を与えるものであり、移動開始直後のニューロンの挙動にリーリンシグナルが必要であることを示す新しい知見である。よって本年度の到達度は順調と考えている。

Strategy for Future Research Activity

1.リーリン蛋白質の皮質深部における発現と機能の解析(続き)リーリン変異マウスを用いたレスキュー実験：脳表層で発現されるリーリン蛋白質の効果を除去して深部のリーリン蛋白質の機能を解析するために、リーリンを発現させた細胞株をリーリン変異マウスの脳スライスに移植し、移動中のニューロンに与える効果を観察する。2.リーリン蛋白質の皮質深部における機能の下流経路のin vivoにおける解析細胞接着因子の関与の検討：リーリンは細胞接着分子α3β1インテグリンと結合することから、リーリンシグナルが細胞接着に関与する可能性が示されているが、深部で発現するリーリンとの関与は不明である。そこで、深部でのリーリン質に反応して移動ニューロンが接着性を変化するか検討する。まず全長のリーリンおよび前年度に得られたスプライシングフォームのα3β1インテグリン・CNRとの結合能をプルダウンアッセイおよび免疫沈降法にて検討する。さらに胎生期14日脳へのエレクトロポレーション遺伝子導入法を用いて、α3β1インテグリンをRNA干渉法により機能阻害し、深部のリーリン蛋白質への反応にこれら細胞接着関連因子が必要であるかを検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度は物品費が当初の予定より安い代替品が発売され、それを用いた事と、予定していた学会に都合により参加できなかったことにより、未使用分が生じた。これらは次年度の物品費として使用し、より多くのサンプルを収集し実験結果の確実性を向上させる予定である。24年度の1,900,000円の使用計画としては当初の計画通り、研究に用いる試薬等消耗品費、学会にて研究成果を報告するための旅費、投稿論文の英文校正料、投稿料に用いる予定である。