2011 Fiscal Year Research-status Report
疾患ｉＰＳ細胞を用いたヒトＴＰＯ／ｃ－ＭＰＬの造血幹細胞制御機構の解明
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23791154
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高山 直也 京都大学, ｉＰＳ細胞研究所, 助教 (10584229)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | 疾患特異的iPS細胞 / 造血不全 |
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| Research Abstract |
疾患特異的iPS細胞は、発症の機序の解明、創薬開発につなげることが期待されている。申請者らは、造血幹細胞増幅因子であるトロンボポイエチン（TPO）受容体c-MPLの遺伝子異常疾患（CAMT；Congenital Amegakaryocytic Thrombocytopenia）患者からiPS細胞を樹立した。正常c-MPLの発現制御を付加する系によりin vitroでの分化実験及び、in vivoの特殊環境下に生着したHSCを用いて、ヒトTPO/c-MPLシグナルが造血幹・前駆細胞の発生及び自己複製・分化制御機構にどのように関与するのかを検証した。その結果、in vitroの血液分化法を用いて、本年度は以下の点を明らかにした。(1)CD34陽性造血前駆細胞の発生効率には正常MPLの発現は明らかな効果はない。(2)CD34陽性造血前駆細胞においては、その細胞の維持、および増殖能にMPL signalが重要な役割を果たしている。(3)MPL欠損によりCD34陽性造血前駆細胞から、各種骨髄球系細胞への分化は障害されるが、巨核球/赤芽球共通前駆細胞段階での障害が顕著であり、この2系統への分化には必須である。(4)レトロウイルスベクターによるWild type MPLの強制発現により遺伝子を修復したCAMT-iPS細胞では、これら分化能の障害は一部改善された。しかし、巨核球分化において、巨核球の成熟マーカーの一つであるフォンウィルファクターレセプター（GPIX、GPIbなど）の発現が低い成熟が止まった巨核球が一部産生されることを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請では、１）一定濃度のTPO存在下でc-MPLの発現量を調節することで、in vitroで顆粒球、赤芽球、巨核球に分化発生に必須であるc-MPLの閾値を定量的に評価する。２）in vivoでc-MPL発現を制御し、奇形腫法で作成したヒト造血幹細胞を用いてMPL欠損により生じる造血幹細胞枯渇機序を解明する。３）遺伝子修復による遺伝子治療モデルを提示する、ことを目的とした。MPL発現を調節できるDD-systemを用いる予定であったが、Shield-1での発現が制御できなかったため、レトロウイルスベクターによる強制発現系を用いた。１）のin vitroでの分化実験において、CAMT-iPS細胞、c-MPL修復CAMT-iPS細胞、コントロールの正常皮膚iPS細胞の3群を比較した。CD34陽性細胞を用いてコロニーアッセイを行うと、CAMT-iPS由来CD34細胞では、すべての骨髄球系細胞でコロニー数の減少が確認できた。さらにCD34陽性分画の細胞はin vitroにおいて維持されず、CD34陽性造血前駆細胞の増殖・維持に重要であることを明らかにした。さらにCD34陽性細胞から、赤血球/巨核球の共通前駆細胞である、CD41a/GlycophorinA共陽性細胞集団への分化課程で著しく障害されていることが明らかになった。３）の遺伝子修復モデルの検討では、レトロウイルスベクターを用いたMPL遺伝子修復により、これらの障害が改善することが確認された。しかし、過剰なMPLにより、異常な巨核球の産生が観察された。以上からin vitroの実験系において、CD34陽性造血前駆細胞およびさらに分化した巨核球/赤血球前駆細胞段階でのMPL signalの役割を明示でき、さらにレトロウイルスを用いた遺伝子修復法の問題点も見いだしているため、比較的順調に進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
遺伝子修復法に関しては、レトロウイルスベクターを用いた強制発現系では、in vitroの分化実験において、50%程度の巨核球がCD41a陽性/GPIX陰性/GPIb陰性の段階で成熟が止まってしまうことを見いだしている。本年度は、そのシグナル強度と巨核球成熟阻害についての影響を遺伝子発現アレイ、定量PCR法で解析する予定である。さらに適正な遺伝子修復法を確立するために、Homologous recombinationを含むベクターシステムの再構築を検討する。ヒト細胞は一般的に相同組み換えの効率が非常に低いことが知られているため、Zinc finger nucleaseによる遺伝子組み換えを予定している。さらに本年度はテラトーマ法により、CAMT-iPS細胞及び遺伝子修復後のCAMT-iPS細胞からの造血幹細胞誘導を試み、生体内での造血幹細胞でのMPL signalの寄与について検討する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
テラトーマ法に用いる免疫不全（NOG）マウス代（15000円/匹）に使用する。in vitroの培養系においては、Homologous recombination法による完全修復型のCAMT-iPS細胞樹立を目指す。Zinc finger法を用いた場合でも、遺伝子修復クローンが得られる可能性は、1%以下であると考えられるため、一過性ではあるが、1000個以上のiPSコロニーの維持が必要となる。また、作成された完全修復型のiPS細胞を用いて分化実験を行うため、比較的大量のサイトカイン（basic FGF, VEGF, SCF, TPO）と培養試薬、細胞解析のための染色抗体が必要である。
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[Journal Article] Heterozygous ITGA2B R995W mutation inducing constitutive activation of the {alpha}IIb{beta}3 receptor affects proplatelet formation and causes congenital macrothrombocytopenia.2011
Author(s)
Kunishima S, Kashiwagi H, Otsu M, Takayama N, Eto K, Onodera M, Miyajima Y, Takamatsu Y, Suzumiya J, Matsubara K, Tomiyama Y, Saito H.
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Journal Title
Blood
Volume: 117
Pages: 5479-5484
Peer Reviewed
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[Presentation] Suspected incomplete reprogramming in blood-derived human induced pluripotent stem cells is advantageous for adult-type erythrocyte generation with globin switching2011
Author(s)
Takayama N, Sano S, Shimizu T., Kawahata R., Endo H., Nakamura S., Ogawa S., Nakauchi H., and Eto K.
Organizer
International Society for Stem Cell Research 9th Annual Meeting (ISSCR)
Place of Presentation
Toronto, Canada
Year and Date
June 15-18, 2011
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[Presentation] TRANSIENT ACTIVATION OF C-MYC EXPRESSION IS CRITICAL FOR EFFICIENT PLATELET GENERATION FROM HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS2011
Author(s)
Takayama N, Nishimura S, Nakamura S, Shimizu T, Ohnishi R, Endo H, Yamaguchi T, Otsu M, Nishimura K, Nakanishi M, Sawaguchi A, Nagai R, Takahashi K, Yamanaka S, Nakauchi H, Eto K.
Organizer
XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
Place of Presentation
Kyoto, Japan
Year and Date
July 23-28, 2011
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