2024 Fiscal Year Research-status Report

可溶性レクチンを用いた関節リウマチ病態制御機構の検討

Research Project

Project/Area Number	23K06414
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	橋本登徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (90712365)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	加納史也徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (40801626)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	関節リウマチ / 乳歯歯髄幹細胞 / Siglec-9 / 破骨細胞
Outline of Annual Research Achievements	ヒト歯髄幹細胞培養上清(SHED-CM)において同定された分泌型Siglec-9(sSiglec-9)による関節リウマチに対する効果の検討をするためにこれまでに以下の検討を行っている。抗2型コラーゲン抗体カクテル誘導関節リウマチモデルマウス(CAIA)にsSiglec-9またはSHED-CMを投与すると関節炎の病態は未治療群に比べ抑制される。Computed Tomography (CT)によってマウス骨組織を評価したところ骨密度が未治療群に比べ治療群で改善していた。さらに組織解析においてもリンパ球浸潤や骨、軟骨破壊の抑制等の結果が得られた。当該年度では破骨細胞へのsSiglec-9およびSHED-CMの影響を解析した。破骨細胞はマクロファージ様細胞株RAW264.7やマウス骨髄由来マクロファージから誘導し、in vitroで効果の検討を行った。その結果種々の破骨細胞マーカーの抑制効果がrealtime qPCRやwestern blottingによる発現解析により明らかになった。またTRAP染色やアクチンリング形成等の解析により特に成熟破骨細胞の形成に影響していることが明らかになった。 SHED-CM中の効果因子については液体クロマトグラフィー・質量分析の網羅的解析を実施し、sSiglec-9以外の分子も同定した。単球系細胞から破骨細胞への分化、成熟化において活性酸素が重要である。sSiglec-9を含むSHED-CMは破骨細胞誘導因子RANKLによる活性酸素ROS産生を阻害し骨細胞分化及び成熟化を阻害することがわかった。その際、抗酸化酵素Heme-oxidase-1(HO-1)やSuperoxide Dismutase 1と2 (SOD1 and SOD2)、glutathione peroxidase 1, 2, 3がSHED-CMによって発現が亢進していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は関節リウマチにおける破骨細胞と滑膜線維芽細胞に対するSHED-CMおよびsSiglec-9の影響を解析する研究である。破骨細胞分化への影響は分化マーカーの抑制効果やROSの産生阻害によることが明らかになった。すでに効果因子の検索は行なっており破骨細胞に対する影響は概ね順調である。また滑膜線維芽細胞の単離はすでに実施されているため順調に進展している。しかしながら試薬費、動物費の高騰により現在動物モデルの変更を検討している。具体的にはCAIAからコラーゲン誘導関節炎モデル(CIA)に変更した。CIAモデルはCAIAに比べII型コラーゲン免疫するステップが増え、モデル樹立までに免疫期間（３週間）が余分にかかる。一方で、関節炎モデルとして十分確立されたものであり、より安価に作成できるCIAモデルマウスで本研究を実施する。
Strategy for Future Research Activity	本研究は関節リウマチにおける破骨細胞と滑膜線維芽細胞に対するSHED-CMおよびsSiglec-9の影響を解析する研究である。破骨細胞分化への影響は分化マーカーの抑制効果やROSの産生阻害効果から明らかになった。sSiglec-9単独でこれらの効果が見られるかどうかを検討する。sSiglec-9とその他の効果因子の検索から得られた効果因子候補の精製品を加える、または阻害することによりどの因子が必要なのかを明らかにする。特に破骨細胞分化には他段階の機序がありどの分子がどのステップに関与するのかを明らかにする。滑膜線維芽細胞の単離はすでに実施されている。腫瘍壊死因子TNFalphaやインターロイキン1beta等で刺激されたのち炎症状態になるが、その際のsSiglec-9とSHED-CMの効果を検討する。 CIAモデルに変更したことからまずSHED-CMの効果について検討する。今後トランスジェニックマウス等の利用も視野に入れる可能性があるため、これまで実施していたDBA1Jマウスに加えB6マウス検討も進める。
Causes of Carryover	(理由)破骨細胞の培養系の樹立に時間を要した。また、それらを評価するには実験動物の誘導が必要になり、動物モデル変更に際して情報収集、条件検討や論文投稿に時間を要したため次年度使用額が生じた。 (使用計画)次年度は主に滑膜線維芽細胞、T細胞や樹状細胞への影響を中心に解析していく。次年度研究費(関節炎モデルマウスに対するSiglec-9の作用機序の解明)と合わせた使用計画である。