2023 Fiscal Year Research-status Report

膠芽腫の増殖抑制を目的にmicroRNA含有ナノ粒子によるセリン合成経路の新規抑制療法

Research Project

Project/Area Number	23K08501
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	中溝玲九州大学, 医学研究院, 准教授 (80529800)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	有村公一九州大学, 大学病院, 講師 (00638025) 村田正治九州大学, 先端医療オープンイノベーションセンター, 教授 (30304744) 吉本幸司九州大学, 医学研究院, 教授 (70444784) 高岸創九州大学, 大学病院, 助教 (70965243)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	glioblastoma / microRNA / miR149-5p / miR615-5p / MTT assay / Western blotting / SHMT2 / PSPH
Outline of Annual Research Achievements	本年度は、膠芽腫におけるセリン合成経路のkey enzymeであるPSPHおよびSHMT2を標的とするmiRを選択し、 in vitroにおいて膠芽腫に対する増殖抑制効果、発現レベルの抑制効果を検証した。他のがん種においてPSPHおよびSHMT2の発現を抑制する作用が報告されているmiRのうち、我々の予備実験において膠芽腫細胞における発現が低いmiR-149-5、miR-615-5pを候補miRとした。増殖能はMTT assayで評価した。miR-149-5、miR-615-5p をtransfectした結果、negative controlをtransfectしたU87と比較し、1日間の培養では増殖能に差はみられなかったが、2-5日間の培養でmiR-149-5p、miR-615-5pをtransfectしたＵ87の増殖能が抑制された。発現レベルはWestern blottingで評価した。上記MTT assayにおいて増殖能がより強く抑制されたmiR-149-5pをtransfectしたU87 において、negative controlをtransfectしたU87と比較し、SHMT2の発現が抑制されており、PSPHの発現も低減傾向にあった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究計画書において、2023年度は候補となるmiRを選定し、膠芽腫細胞にtransfectして、PSPHおよびSHMT2の発現レベルの変化と増殖能の変化を検証する予定であった。そのうえで、最もPSPHおよびSHMT2の発現を抑制し増殖抑制作用が強いmiRを同定する方針であった。PSPHとSHMT2の発現レベルはWestern blotting、増殖能はMTT assayにて検討する予定としていた。結果として、候補としたmiRのうち、第一候補のmiR149-5pをtransfectしたU87細胞株において、MTT assayで増殖能が抑制され、Western blottingでSHMT2とPSPHの発現が抑制されることを確認した。また、miR615-5pをtransfectしたU87細胞株において、MTT assayで増殖能が抑制されることを確認した。培養条件、miRの濃度、検体数において今後も実験を継続する必要はあるが、2023年度の計画を概ね遂行できたと考えられる。
Strategy for Future Research Activity	本年度の実験の結果より、10µMおよび20µMに調製したmiR149-5pをtransfectしたU87細胞株において、MTT assayで増殖能が抑制され、Western blottingでSHMT2の発現が抑制されることを確認したが、miRの濃度を変化することでも同様の結果が得られるか検証する。さらに、膠芽腫に指向性を有するナノパーティクル(NP)を開発すると同時に、レンチウイルスベクターを用いたmiRを強発現した間葉系幹細胞(MSC)を作製する(miR-MSC) 。また、膠芽腫モデルマウスの開発を検討する。
Causes of Carryover	予定よりも早くmiRの選定が可能であったことから、次年度使用が生じた。次年度は、miRの濃度を変更してMTT assayやWestern blottingを行い、増殖能や発現レベルが抑制されるか検証する。delivery systemであるNPの開発および膠芽腫モデルマウスの開発に使用する。