間葉系幹細胞の骨芽細胞分化におけるメカノセンサー、メカノトランスダクションの解明

2024 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K09436
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 赤澤 友基 徳島大学, 病院, 助教 (10646152)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉村 善隆 北海道大学, 歯学研究院, 准教授 (30230816) ; 長谷川 智一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 講師 (50274668)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / メカノセンサー / メカノトランスダクション / 乳歯歯髄由来細胞

Outline of Annual Research Achievements

細胞の分化に細胞外環境が重要であることはよく知られている。伸展力や圧迫力などの機械的刺激が骨芽細胞分化に影響を及ぼすことは多数報告されている。しかし、どの報告の力も生体内に換算すると大きな力で、わずかな力による報告は少ない。研究代表者らは間葉系幹細胞株UEF7-13に微小な圧迫力をかけることで、骨芽細胞に分化することを確認した。これは分化誘導因子を添加することなく石灰化を認めたことから、機械的刺激のみで成熟した骨芽細胞への誘導が可能なことを示唆している。本研究では、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化に関与するメカノセンサーの同定とその下流のメカノトランスダクションの解明、およびその臨床応用を目的とする。
昨年度末に間葉系幹細胞が死ぬことなく培養することができたので、様々な圧力下で培養を行う予定であった。しかし、今度は同細胞を通常の圧力下で石灰化誘導培地にて培養した際にあまり石灰化をしなくなってしまった。再度、細胞株を購入し、同様に石灰化誘導培地にて石灰化誘導を行ったが、細胞株自体が古くなっているようであまり石灰化しなかった。そこで、購入しなおした細胞株を用いてsingle cell cloningを行い、石灰化する細胞株の作成を行った。現在も細胞株の選定を行っている最中である。
予定していた間葉系幹細胞での実験が進まないため、別に保有していた乳歯歯髄由来細胞に圧迫刺激（血圧を想定した圧力）を加えることによる細胞の変化の分析を行っている。こちらの方からは、圧力を加えることによりSDF-1の発現が減少するというデータが得られている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度は、使用を予定していた細胞（骨髄由来間葉系幹細胞）に問題が生じたため、再度細胞を購入したり、single cell cloningを行ったりと、細胞の調整に時間がかかっている。まだ、安定した細胞を得ることができておらず、選定中である。
そのため、細胞を変更し、乳歯歯髄由来細胞を用いて圧力刺激による細胞の挙動の解明を行っている。
以上により遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

現在、骨髄由来間葉系幹細胞のsingle cell cloningを行い、使用できる細胞株の選定を行っている最中である。細胞株が決定したのちには、予定していた微弱な圧力による細胞の石灰化におけるメカノセンサー、メカノトランスダクションの解明を行う予定である。
ただ、細胞株の選定までの間は、これまでに当科で分離・株化していた乳歯歯髄由来の細胞株を用いて、同様に圧刺激下の細胞の挙動について研究を行う予定である。その際にはDNA chip / microarrayを使用して候補遺伝子を決めていく予定である。変化のある候補遺伝子の中から細胞骨格、膜蛋白質、細胞外基質に的を絞り、その分子機能の阻害剤、agonisit、中和抗体等を使用して骨芽細胞への分化に影響があるかどうかを検討していく。さらに予想される遺伝子のsiRNAなどで機能のknock-down等で確認を行う予定である。同定されたメカノセンサー（機械受容体）からの細胞内シグナルの検討を行う。これには阻害剤やagonistを使用して細胞内シグナル経路の予想を行いながら検討する予定である。最終的にはwestern blottingにより確認する予定である。

Causes of Carryover

細胞の不具合などで予定していた研究が進まず、購入予定だった試薬や抗体などを購入できなかったため次年度使用額が生じた。
翌年度分の研究費と合わせて試薬や抗体、キットなどを購入する予定である。