2024 Fiscal Year Research-status Report
In planta screening of chamicals targeting the protein-protein interactions for plant reproduction
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23K17992
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山岡 尚平 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (00378770)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / 植物細胞 / 化合物スクリーニング / ライブイメージング / 有性生殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、タンパク質間相互作用(PPI)の新規検出法であるFluoppi (Watanabe et al., 2017)に基づき、生きた植物細胞内でPPIの有無を検出できる新しいベクターをつくる。そして植物の生殖過程に関わるPPIを検出するレポーター植物を作出し、化合物スクリーニングを行うことで、そのPPIを標的とする「分子標的農薬」の候補となる化合物を得る。
本年度は、花粉管誘引に関わるペプチドLUREとその受容体PRK6のPPIを検出するベクターを作成し、一過的発現アッセイを行って、FluoppiによりPPIが検出可能であることを示した。また、昨年度までに作成した、生殖細胞分化に関わるbHLH転写因子BNB-LRLのヘテロ二量体形成におけるbHLHドメイン間のPPI、およびジャスモン酸(JA)シグナル伝達に関わる受容体COI1と転写調節因子JAZ1のJA関連化合物依存的なPPIを検出するベクターについて、一部のプロモーターを誘導発現型に換えたのち、シロイヌナズナの安定形質転換体を作出した。得られたラインについて、T2の分離比の検定とウェスタンブロットによりベクターのコピー数とレポータータンパク質の発現を確認したのち、交配を行った。現在、F1の育成を行っており、来年度にその中からFluoppiアッセイが可能な植物を選抜する。
また、自動播種装置と蛍光顕微鏡システムを用いて、384プレートでのシロイヌナズナ芽生えの育成と蛍光レポーターの半自動的な検出方法を検討した。その結果、比較的短時間で全個体での蛍光検出が可能な方法を見出した。来年度では上記で確立したFluoppiレポーター株を用いて検出条件の最適化を行った上で、化合物スクリーニングを実施し、新規化合物を同定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の主目的のひとつである、花粉雄原細胞分化に関わるBNB-LRL、花粉管誘引に関わるLURE1-PRK6、ジャスモン酸シグナル伝達に関わるCOI1-JAZ1について、Fluoppiによる各PPIの検出が可能なことを示すことができた。また、レポーター植物の系統確立の見通しも得られたが、当初の目標であった本年度中での全てのPPIでのレポーター植物確立には至らなかった。一方、蛍光顕微鏡によるレポーターの検出システムについては開発を進めることができた。来年度はレポーター植物を用いた化合物スクリーニングを実施できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度に、植物の有性生殖に関わる上記３つのPPIを検出するFluoppiレポーター植物の系統を確立する。COI1-JAZ1のレポーター植物を用いて、PPIの可逆性をFluoppiが検出可能であることを示すとともに、PPIの反応速度論的解析を行い、植物細胞でのFluoppiによるPPI検出法の具体例を示す。レポーター植物の系統確立を行い、Fluoppi蛍光の検出法の最適化を行う。化合物スクリーニングを実施し、上記３つのPPIに影響する化合物を探索・同定する。また、得られた化合物を用いて、植物個体・組織・細胞レベルでの生理作用を検証する。以上の成果を、植物におけるFluoppiレポーターシステム確立と、植物の有性生殖に関わるPPIに作用する化合物の同定と生理機能解析についてそれぞれ述べた２つの論文として発表する。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗がやや遅れ、レポーターラインの確立のために予定していた実験を開始しなかったため、次年度使用額が生じた。次年度では当該実験の実施に充てる。
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