2021 Fiscal Year Annual Research Report
Genetic analysis of species-specific haplotype diversification causing rice reproductive isolation.
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21H02168
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
山形 悦透 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00600446)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 雑種不稔 / ハプロタイプ / 分化進化 / イネ / Oryza属AAゲノム種 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(研究1) 野生種に由来するS21領域のゲノム配列の解明について、O. nivara (Acc. IRGC105715)のS21領域について、PacBioによるロングリード解読を行い、タンデム重複領域のゲノム配列を調査した。BACクローン解読では複数回のタンデム重複領域の存在が示唆されたが、ロングリード解析ではタンデム重複は存在せず、両者の結果は異なっていた。重複領域の配列はほとんど同一であるため、アッセンブルが困難であった可能性が考えられた。
(研究2) RIPの時空間的発現と局在に関する種間の比較では、S21-mer, S21-niv由来ORF2のゲノムあるいはcDNAのクローニングを行った。クローニングが困難な遺伝子であり、当初は全くクローンを得ることができなかったが、大腸菌内在プラスミドのコピー数や発現リーク抑制を行うベクターを数種類取り組むことで解決することができた。現在gfpに結合した発現局在コンストラクトの作成を進めている。
(研究3) 相互作用因子の同定と高精度連鎖解析; S21-merとS21-nivの交雑後代において観察されるS21-mer/S21-nivヘテロ接合体について、花粉半不稔と花粉正常の2クラスが分離したため次世代シーケンサーによる遺伝的背景を探索したところ、染色体9にO. nivaraに由来する染色体断片の導入が観察された。当該領域にS21と相互作用する新規遺伝子(SIG(仮称))が存在することが期待されたため、DNAマーカーを作成しQTL解析の手法を用いて関連を調査したところ、関連が示唆された。本領域近傍にSIG遺伝子が座乗している可能性が示唆された。さらなる同定を進めるため、後代集団を展開するための種子を採取し、高精度連鎖解析を進める準備を整えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(研究1) 野生種に由来するS21領域のゲノム配列の解明: 計画に基づき、BACクローンのPACbioシーケンスを行い、原因遺伝子が座乗している領域のゲノム構造の検討を行うことができた。これまで推測されてきたゲノム配列と大きく異なる点はなかったが、タンデム重複数としてはアーティファクトの可能性も視野に入れながら研究を進める。ORF2およびORF1に関するCRISPR/Cas9コンストラクトも作成終了しており、順次形質転換を行う状況を整えた。(研究2) RIPの機能解析: RIPの時空間的発現と局在に関する種間の比較: 当初、ORF2のクローニングを進めたが、難クローニング遺伝子であり難航したが、コピー数やクローニング領域のリーキー発現を抑制する遺伝子の利用により、当初年度内に達成することができた。この産物を利用してgfp融合コンストラクトや機能解析に必要な発現コンストラクトの作成も問題なく進めることができている。(研究3) 相互作用因子の同定と高精度連鎖解析: S21の相互作用遺伝子座SIGに関して、当該ゲノム領域が明らかとなっていなかったが、ゲノム配列解読と分離集団を用いた遺伝解析により、染色体9に量的形質遺伝子座関連領域を見出し、近傍のSSRマーカーを同定することができた。QTL領域の遺伝子型から期待される表現型と異なる表現型を示す個体が表れる場合があり、表現型が安定しない量的形質の可能性がある。この結果は想定外の結果であり、興味深い。
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| Strategy for Future Research Activity |
(研究1) 野生種に由来するS21領域のゲノム配列の解明: PACbioシーケンスの結果とBACクローン解読の結果を比較すると、原因遺伝子が座乗していると考えているゲノム領域に存在するタンデム重複について、差異が生じている。重複遺伝子間の構造の違いは遺伝的機能にクリティカルにかかわる可能性があるので、慎重に進める。量的PCRなどの別の方法を用いて多角的に検証し、タンデム重複のコピー数の把握に努める。コピー数が明らかになれば、遺伝子予測を進め、計画通りRNA-seqをによる時空間的な発現プロファイルについて、種間で発現遺伝子および構造の変異について詳細に検討できる基盤が整備されると期待される。
(研究2) RIPの機能解析: RIPの時空間的発現と局在に関する種間の比較では、初年度にクローニングしたcDNAを用いてgfp融合遺伝子の発現局在コンストラクトを形質転換し、RIPの局在について明らかにする。ORF2のRIP活性の変異の解析については、初年度に得られたcDNAを用いて発現コンストラクトの作成と大腸菌でのタンパク質合成と活性試験を進める。
(研究3) 相互作用因子の同定と高精度連鎖解析: S21の相互作用遺伝子座SIGに関して染色体9のゲノム領域が候補となっているが、質的な表現型分離を示さず、量的形質遺伝子座(QTL)解析でしか関連が示唆されていない問題点がある。染色体9の当該領域の遺伝子型から推測される表現型と一致しない個体も現れており、後代検定を行うなどのさらなる検証が必要な状況である。
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Research Products
(4 results)
