2021 Fiscal Year Annual Research Report
In-cell分光法によるアミロイドβ産生制御機構・構造変化の解明と創薬
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21H02615
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
松崎 勝巳 京都大学, 薬学研究科, 教授 (00201773)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星野 忠次 千葉大学, 大学院薬学研究院, 准教授 (90257220)
河野 健一 京都大学, 薬学研究科, 助教 (70732874)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アルツハイマー病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）40残基からなるアミロイドβタンパク質（Aβ40）を遺伝子組み換え技術により大腸菌で作成した。神経系細胞であるSH-SY5Y細胞をGe上に播種し、細胞膜上でのAβ40の構造変化を、測定直前に重水バッファーに置換することにより、水由来の吸収の影響を低減させ、FTIR-ATR法によりモニターした。その結果、アミロイド線維形成直後には、逆平行βシート由来のバンドが観測されたのに対し、時間経過とともにこれが消失し、平行型へと変化してゆくことが明らかとなった。また、2色の蛍光色素で標識されたAβ40を用いることにより、この構造変化は線維断端で起こることが示唆された。
2）細胞膜上でG9C-AβとA30C-Aβとの間のクロスリンク反応を行う条件を検討したが、クロスリンク時までに添加する還元剤により、細胞がダメージを受けることが判明した。
3）2番目のアミノ酸に蛍光色素Bodipyを導入したAβ40を調製し、エキサイマー形成により平行型／逆平行型βシートの区別を試みたが、Bodipy導入により、線維形成自体が阻害された。また、N末端に環境応答性色素NBDを導入したAβ40を用いても平行型／逆平行型の区別を試みたが、細胞上での蛍光強度が弱く、検出が困難であった。
4）Aβ42を遺伝子組み換え技術により大腸菌で作成し、SH-SY5Y細胞に対する毒性評価を行うための、最適条件を見出さした。
5）平行型／逆平行型混合型の毒性型テープ状アミロイド線維に結合する化合物および逆平行シートの端面に結合して、その形成を阻害する化合物をin silicoスクリーニングにより選定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の大きな目的の一つである生細胞膜上でのAβ40線維の構造変化をモニターすることに成功したため。
また、Aβ線維形成阻害剤スクリーニングのための準備が整ったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）生細胞膜上でのAβ40の構造変化の詳細を得る方策を検討する。
2）Aβ線維形成阻害剤スクリーニングを本格的に行う。
3）我々の開発したコイルドコイル蛍光標識法を用い、APPのモノマーダイマー平衡を制御している因子を明らかにする。
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