2022 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanism and its physiological significance of metal coordination in Tyrosinase family proteins
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22H02257
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
神戸 大朋 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90303875)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 紀彦 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40724612)
木下 政人 京都大学, 農学研究科, 准教授 (60263125)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | メラニン色素 / チロシナーゼ酵素群 / 亜鉛 / 銅 / 亜鉛輸送体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メラニン色素の生合成には、チロシンナーゼ（TYR）、チロシナーゼ関連タンパク質1と2（TYRP1、TYRP2）の３つの酵素が重要な役割を果たす。これらの中で、TYRは銅が配位する銅酵素であり、この銅を供給する銅輸送体ATP7Aが同定されている。そのため、TYR と相同性の高いTYRP1とTYRP2も、銅酵素であると長年信じて疑われてこなかったが、最近我々は、TYRP1がこれまでの予想に反して、銅ではなく亜鉛によって制御されることを見出し、さらに、亜鉛トランスポーターZNT5-6とZNT7がTYRP1に亜鉛を供給することを発見した。この知見をさらに詳しく検証するために、ZNT5-6ヘテロ二量体とZNT7ホモ二量体の機能を欠損させたメラノーマ細胞およびメダカを用いて個体レベルで検証したところ、予想通り、両ZNT複合体が実際にTYRP1の制御を介してメラニン生合成に関わることを確認した。メラノーマ細胞を使用した再発現解析を使用した詳細な解析の結果、両ZNT複合体が輸送した亜鉛がないと、TYRP1が安定に発現できないこと、さらに両ZNT複合体によるTYRP1の制御がヒトやマウス、ニワトリでも保存されていることを確認した。メラニン生合成においては、TYRP1の機能発現のメカニズムは長年の謎であり、本知見は、その謎に新しい知見を提示する結果となった。TYRP1は、メラノーマの予後不良とも関連があることが知られており、本成果は美容や医薬をはじめとする幅広い分野に新しい展開をもたらすものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
同定した亜鉛輸送体（ZNT5-6とZNT7）が実際にTYRP1の発現制御を介してメラニン生合成に関わることを、細胞レベルおよびメダカを用いた個体レベルでの解析で証明し、論文発表につなげることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
・TYRとTYRP1の間でいくつかの領域を交換したキメラ変異体を作成し、これらの変異体をZNT5-6とZNT7の機能欠損株およびATP7A欠損株に導入して、TYRP1とTYRの活性・発現を完全に入れ換える変異体を同定し、TYRP1とTYRの特性を制御する最小領域を特定する。この領域に結合して相互作用する分子を免疫沈降にて精製し、質量分析装置（LC-MS/MS）を用いて同定する。同定した分子の機能解析を実施し（欠損株を樹立し、細胞機能解析や亜鉛応答性に関する解析他を計画）、ZNT5とZNT7がどのようにTYRP1とTYRを区別して亜鉛を供給するのか、あるいは、なぜTYRには銅で、TYRP1には亜鉛が結合するのかなど、未知の制御機構に関する知見を収集する。
・ヒトメラノーマSK-MEL-2細胞やマウスメラノーマB16細胞の野生株およびZNT5ZNT7二重欠損株から代謝産物を抽出してメタボローム解析を実施する。二重欠損株で影響を受ける代謝経路を精査し、メラニン生合成経路との関連について明らかにする。さらに、TYRの活性発現に不可欠となる銅輸送体ATP7A欠損株のメタボローム解析の結果と比較することで、ZNT5とZNT7がメラニン生合成にどのように関わるのか、その分子機序を明示する。
・亜鉛輸送体欠損株ライブラリーにTYRP2を発現させ、TYRP2の活性・発現を変化させる株を特定する解析を並行して実施し、TYRP2に配位する金属に関する情報の収集に努める。
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