2023 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of gene networks associated with secondary cell wall layer structure.
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22H02412
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Forest Research and Management Organization |
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Principal Investigator |
高田 直樹 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (90605544)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 真吾 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (00783664)
杉山 淳司 京都大学, 農学研究科, 教授 (40183842)
粟野 達也 京都大学, 農学研究科, 助教 (40324660)
永野 聡一郎 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 林木育種センター, 主任研究員 等 (50753836)
七里 吉彦 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (80461292)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 二次壁 / 層構造 / 表層微小管 / セルロースミクロフィブリル / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
二次壁はセルロースミクロフィブリルの配向角度の違いにより3層に区別される。セルロースミクロフィブリルの配向は表層微小管により制御されており、表層微小管とセルロースミクロフィブリルの配向には同調的な変化が見られる。しかし、二次壁の層構造が構築される過程で表層微小管の配向がどのような分子基盤により制御されているかについて多くの謎が残されている。研究代表者らはポプラを用いた遺伝子スクリーニングの結果、S2層の形成を担う転写因子(TF26およびTF26b)を同定している。そこで、本研究ではTF26/26bを起点としたS2層の形成機構の解明とTF26/26bの進化的機能保存性の解明を試みる。
前年度までに実施したRNA－sequencing解析の結果、TF26およびTF26bの下流で機能する微小管関連タンパク質を約200個同定した。これらのタンパク質のうち、壁層構造を制御する候補遺伝子のターゲットとして18個を選定した。これら18遺伝子には互いにパラログの関係性を持つものが多い。そこで、パラログを同時に破壊するように設計したCRISPR-Cas9用遺伝子コンストラクトを全10個準備し、ポプラへ遺伝子導入を行った。その結果、14遺伝子（8コンストラクト）について両対立遺伝子で機能欠損が生じたポプラ変異体の作製に成功した。さらに一部の変異体については、鉢上げを行い木部組織の顕微鏡観察を行った。
スギのTF26/26bオルソログ（２遺伝子）について、CRISPR-Cas9システムを用いて遺伝子欠損スギの作製を試みた結果、各遺伝子につき１つの遺伝子コンストラクトでは機能欠損が生じたスギの作製に成功した。一方で、その他の遺伝子コンストラクトでは遺伝子欠損スギが得られなかったことから、新たにガイドRNAを設計しなおすとともに遺伝子コンストラクトを作製し、再度スギへの形質転換を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TF26/TF26bの下流で機能する微小管関連タンパク質の同定では、TF26およびTF26bにより制御される約200個の微小管関連タンパク質を同定した。また、TF26およびTF26bが直接的に結合するゲノム領域を決定するためにDAP-sequencingを計画しており、TF26およびTF26bのリコンビナントタンパク質の精製およびゲノムライブラリーの作成まで終了している。
二次壁の層構造形成への関与が推定される微小管関連タンパク質(18遺伝子)について機能欠損変異体の作製を行い、これまで14遺伝子（8コンストラクト）についてポプラ変異体を取得している。さらに、一部の変異体については、鉢上げを行い木部組織の顕微鏡観察を行った。
TF26/26bオルソログを遺伝子欠損したスギの作製では、まず4つのガイドRNAを用いて形質転換を行い、1つのガイドRNAについては候補個体の取得に成功した。しかし、1つのガイドRNAから得られた個体のみではその後の形質評価に不十分であるため、各遺伝子につき追加で複数のガイドRNAを設計し、CRISPR/Cas9システム用の遺伝子コンストラクトを作成し、スギへの形質転換を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
DAP-sequencing解析を行うとともに、これまでに取得したRNA-sequencing解析の結果を統合的にデータ解析することで、TF26およびTF26bが直接制御する遺伝子群を明らかにする。
微小管関連タンパク質を機能欠損したポプラでは、鉢上げした後に閉鎖系温室での生育を開始する。また、約３ヶ月生育したポプラから木部試料をサンプリングし、顕微鏡を用いて二次壁の壁層構造の観察を行う。
TF26/26bオルソログを遺伝子欠損したスギの作製では、新たに設計した遺伝子コンストラクトを用いてスギの機能欠損変異体を作製する。また、これまでに作製した変異体については、木部試料をサンプリングし顕微鏡を用いて木部組織観察を行う。
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