2023 Fiscal Year Annual Research Report

狙ったDNAが過剰メチル化された疾患モデル動物作製法の開発

Research Project

Project/Area Number	22H02537
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	堀居拓郎群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (00361387)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	森田純代群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (40589264) 安部由美子群馬医療福祉大学, 医療技術学部, 教授 (70261857)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	エピゲノム編集 / DNAメチル化 / dCas9 / プラダー・ウィリー症候群
Outline of Annual Research Achievements	令和5年度はプラダー・ウィリー症候群（PWS）モデルマウスの作製法の検討を行った。いずれも過剰排卵処理したB6D2F1マウスを同系統の雄と交配させ、膣栓を確認した日の午後に受精卵を回収し、以降の実験に用いた。マウス作製を堀居が、エピゲノム編集ベクターの構築を森田が行った。 ①トランスジェニック（TG）マウスの作製と胎子期のDNAメチル化解析：各種エピゲノム編集ベクターを線状化あるいは環状のまま受精卵の前核に注入し、エピゲノム編集胚を作製した。残念ながら2細胞期胚で発生が停止したため、それ以上の実験は行わなかった。 ②４倍体補完によるES由来個体の作製と胎子期のDNAメチル化解析：過剰メチル化させたES細胞を４倍体の宿主胚（胚盤胞）に注入し、キメラ胚を作製した。キメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、妊娠中期（妊娠12.5日）に回収を行った。４倍体補完法では、宿主胚は胎盤としてのみ寄与するため、得られる胎子はほぼ完全にES細胞由来細胞からなる。しかし、残念ながら胎盤形成はあるもののES細胞由来の胎子を得ることができなかった。 ③キメラマウスの作製と胎子期のDNAメチル化解析：過剰メチル化させたES細胞を宿主胚（胚盤胞）に注入し、キメラ胚を作製した。キメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、妊娠中期（妊娠12.5日）に回収した。回収した胎子をトリプシン消化し、繊維芽細胞（MEF）を作製した。フローサイトメーター（FACSAriaII）を用いて、ES由来細胞の寄与率の測定とソーティングを行い、Snrpn-DMRの過剰メチル化が維持されていることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和5年度に申請書で計画した3種類のエピゲノム編集マウス作製法について検討し、キメラマウス作製によりエピゲノム編集マウスが得られたため、この評価とした。
Strategy for Future Research Activity	令和6年度はPWSモデルマウスの表現型解析を進める。PWSは、内分泌・神経・奇形症候群である。染色体１５ｑ上の遺伝子発現異常による視床下部の機能障害のため、満腹中枢をはじめ体温、呼吸中枢などの異常が惹起される。その結果、内分泌学的異常として肥満、低身長、性腺機能障害、糖尿病などがみられる。本年度では、下記表現型について調べ、PWSモデルマウスが患者の症状を再現しているのか確認する。呼吸代謝測定は、生体調節研究所の内分泌代謝拠点プログラムの技術的支援を受けて実施する。呼吸代謝以外の項目については、研究室で日常的に行っている項目であり、技術的あるいは設備的な問題はない。現時点では4、8、12、16週齢での測定を検討しているが、病気の発症具合に応じて臨機応変に対応する。血糖値測定は森田が、それ以外を堀居が担当する。解析を終えたマウスの脳視床下部を回収し、DNAメチル化解析および発現解析を実施、表現型との関連を検証する。 ①体重・摂食量測定（4〜16週齢）：マウス用マルチフィーダー（シンファクトリー社）を用いて摂食量を測定する。 ②体脂肪・体長測定（〜16週齢）：所属する生体調節研究所で保有する小動物用micro-CT（Latheta LCT-200、日立）を用いて、体脂肪率および体長の測定を行う。 ③呼吸代謝測定（〜16週齢）：所属する生体調節研究所で保有する呼吸代謝モニタリングシステム（Oxymax）を用いて、酸素消費量、二酸化炭素産出量、呼吸商、エネルギー消費量を測定する。 ④尿糖・血糖値測定（〜16週齢）：尿糖の測定、糖負荷試験およびインスリン負荷試験により、糖尿病の発症を確認する。