2023 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the mechanism of hepatitis B virus entry and control of infection by entry inhibitors
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22H03062
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
伊藤 清顕 愛知医科大学, 医学部, 教授 (50551420)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇根 瑞穂 広島国際大学, 薬学部, 客員教授 (20144826)
大澤 匡範 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
梅澤 一夫 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70114402) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | B型肝炎ウイルス / 侵入機構 / 侵入阻害 / 感染制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B型肝炎ウイルス（HBV）感染に対しては現行の治療では完全排除が望めず、多くの持続感染者が差別の問題や発癌のリスクを抱えている。我々は、胆汁酸誘導体の一つであるINT-767がHBVに直接結合してHBVの感染を強力に阻害することを発見した。INT-767は副反応によりヒトへの投与が難しいため、本研究によりHBVの侵入機構を分子レベルで解明し、有効性および安全性が高くHBVの侵入を完全に阻害する胆汁酸誘導体の開発を進めた。HBVの持続感染者においても、感染している肝細胞は全体の一部であり、未感染肝細胞への感染を完全に阻害することができればHBVの排除は可能になる。
我々は、本研究において未感染肝細胞への感染を完全に阻害するために、肝臓におけるHBVの感染受容体であるナトリウム依存性胆汁酸輸送担体（NTCP）を介した感染だけでなく、隣り合う細胞間での感染（cell to cell transmission: CCT）が存在するか、また存在するとしてその持続感染維持に与えるインパクトを解析した。HBV感染受容能をもつGFP-NTCP安定発現株を樹立しCCTの有無を確認したところ、CCTの存在は否定的であった。
HBVはpreS1領域のN末端側やC末端側の疎水性領域を利用してNTCPとの結合やエンドソーム膜と膜融合して巧みに細胞内に侵入していることが判明した。また、INT-767はHBVのpreS1領域とNTCPとの結合を阻害するだけでなくエンドソーム膜との膜融合も阻害するという結果を得た。
慶應義塾大学薬学部との共同研究により、INT-767のpreS1領域への結合様式を解明するために、NMR解析に適したINT-767と相互作用するpreS1部分ペプチドのサイズを決定した。さらには、安定同位体標識されたpreS1部分ペプチドの発現系を確立し、NMRシグナルの観測にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
未感染肝細胞への感染を完全に阻害するために、NTCPを介した感染だけでなくCCTの有無およびそのインパクトを解析した。HBV感染受容能をもつGFP-NTCP安定発現株を樹立し、CCTのみならずエンドソーム膜との膜融合も評価を可能にする実験系を構築した。その結果、胆汁酸誘導体INT-767がHBVのpreS1領域とNTCPとの結合を阻害するだけでなくCCTやエンドソーム膜との膜融合も阻害するという結果を得た。
INT-767および類似しているが異なる化学式を持つオベチコール酸をヒト肝細胞キメラマウスに経口投与し肝臓のRNA-seq解析を行った結果、特異的に抗HBV効果に関連するシグナル伝達経路の遺伝子発現変動を認め、INT-767が持つ新規の抗HBV作用機序を発見した。
慶應義塾大学薬学部との共同研究によりINT-767のpreS1領域への結合様式解明に向けて、NMR解析に適したINT-767と相互作用するpreS1部分ペプチドのサイズを決定した。さらには、安定同位体標識されたpreS1部分ペプチドの発現系を確立し、NMR解析が可能になった。
リード化合物であったAH-337の薬物動態および毒性、安全性評価をするために、ヒト肝細胞キメラマウスに経口投与した。投与後のマウスより採取した血液および胆汁よりAH-337が検出されたことから、本薬剤が腸肝循環することが示唆された。同マウスの肝臓を使用したRNA-seq解析の結果、肝毒性を示すような遺伝子変動は認められなかった。
胆汁酸誘導体ライブラリをin vitro HBV感染モデルに使用した結果、これまでのリード化合物であったAH-337 よりも高い抗HBV効果を持つAH-366 およびAH-390 を見出した。
以上のことから、本研究は予定した計画に対しておおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、胆汁酸誘導体または低分子化合物とHBVとの結合様式を解明するため、in vitro HBV感染モデルおよびin vivo HBV感染モデルを使用した解析を進める。さらに慶應義塾大学薬学部との共同研究により構築したNMR解析法を使用して、さらに詳細なHBV preS1領域と胆汁酸誘導体との結合様式を解明する。preS1・NTCPモチーフとNTCPの結合様式を標的に、有効な胆汁酸誘導体もしくは低分子化合物をデザイン、合成展開し、HBVに対する感染阻害効果を検証する。また、preS1-エンドソーム膜融合定量システムを使用し、HBVのCCTおよびエンドソーム膜との膜融合を標的としたHBV阻害薬の開発を進める。
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[Presentation] 14-3-3ζによる転写因子FOXO3aの阻害メカニズムの解明2023
Author(s)
榎本翔太, 桑山知也, 中塚将一, 横川真梨子, 河津光作, 中村吏佐, 木村友美, 田辺幹雄, 千田俊哉, 齋藤潤, 佐谷秀行, 大澤匡範
Organizer
第46回分子生物学会年会
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[Presentation] タンパク質-タンパク質相互作用をターゲットとした感染阻害大環状物質の探索と構造活性相関解析2023
Author(s)
米澤朋起, 清水祐吾, 池田和由, 山本雄一朗, 野口耕司, 酒井祥太, 深澤征義, 浅見仁太, 清水敏之, 大戸梅治, 横川真梨子, 大澤匡範
Organizer
第51回構造活性相関シンポジウム
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[Presentation] 14-3-3ζによる転写因子FOXO3aの阻害メカニズムの解明2023
Author(s)
榎本翔太, 桑山知也, 中塚将一, 横川真梨子, 河津光作, 中村吏佐, 木村友美, 田辺幹雄, 千田俊哉, 齋藤潤, 佐谷秀行，大澤匡範
Organizer
第62回NMR討論会
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[Presentation] Novel monoclonal antibody and ADAM17 enzymatic inhibitor could induce NK cell-mediated cytotoxicity in HCC by targeting NKG2D ligands2023
Author(s)
Arai J, Sakamoto K, Okumura A, Ibusuki M, Kitano R, Kimoto S, Inoue T, Kobayashi Y, Nakade Y, Kato N, Ito K
Organizer
APASL Oncology 2023 Sendai
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[Presentation] Discovery of the middle-sized compounds inhibiting the SARS-CoV-2 viral entry, using in silico approach and NMR analysis2023
Author(s)
Yokogawa M, Horiuchi H, Kaneichi S, Otake T, Yonezawa T, Shimizu Y, Ikeda K, Yamamoto Y, Sakai S, Noguchi K, Fukasawa M, Osawa M
Organizer
CBI学会2023年大会
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[Presentation] AH-337 is a novel bile acid derivative designed to inhibit HBV entry2023
Author(s)
Okumura A, Yamashita Y, Iguchi Y, Yokogawa M, Ohashi H, Arai J, Umezawa K, Ikeda K, Osawa M, Watashi K, Wakita T, Une M, Ito K
Organizer
2023 International HBV Meeting
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[Presentation] HBV PreS1/NTCP相互作用を標的とした阻害剤簡易スクリーニング系の構築2023
Author(s)
堀渕慶太, 入間田早瑛, 山本雄一朗, 横川真梨子, 清水祐吾, 米澤朋起, 池田和由, 浅見仁太,清水敏之, 大戸梅治, 深澤征義, 大澤匡範, 野口耕司
Organizer
第６７回日本薬学会関東支部大会
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[Presentation] NMRを活用したSARS-CoV-2スパイクタンパク質とhACE2の相互作用を標的とするSARS-CoV-2侵入阻害化合物の分子設計2023
Author(s)
横川真梨子, 堀内まほろ, 金一駿希, 大竹帝河, 米澤朋起, 清水祐吾, 池田和由, 山本雄一朗, 酒井祥太, 野口耕司, 深澤征義, 大澤匡範
Organizer
第23回日本蛋白質科学会年会
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