2022 Fiscal Year Annual Research Report
オルガノイドを用いた脂肪由来幹細胞からの超高機能肝細胞様細胞の確立
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22H03136
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
島田 光生 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10216070)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
常山 幸一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10293341)
池本 哲也 徳島大学, 病院, 特任教授 (20398019)
安友 康二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (30333511)
齋藤 裕 徳島大学, 病院, 講師 (50548675)
森根 裕二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (60398021)
親泊 政一 徳島大学, 先端酵素学研究所, 教授 (90502534)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | オルガノイド / 脂肪由来幹細胞 / 肝細胞様細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝細胞様細胞（HLC）は多能性幹細胞から分化誘導が可能であるが、すべての肝細胞機能を肝細胞と同等に保持するようなHLCはいまだに作製できていない。これまでとは異なる新たなアプローチによって、より肝細胞に近い、超高機能肝細胞様細胞 (Super HLC)の作成方法が必要である。また、Super HLCの他家移植を考慮した際に、その免疫原性の評価も重要となる。
本研究では以下の検討内容を明らかにすることを目的とする。
1. ADSCにより誘導されたHLCを“新たな薬剤添加・NH3 precondition”で高機能化し、その高機能HLCと血管内皮細胞とのオルガノイドを形成する。多細胞間の相互作用を人工的に再現することで、従来の分化誘導手法の抜本的改良を試みることができ、我々の目標とするSuper HLCを創出する。
2. ADSCからSuper HLCまでの過程における免疫原性を評価。
3. Super HLCの代謝性肝疾患モデルへの移植。
R4年度は、ADSCからの分化誘導の過程,でこのHUVECを混入し、オルガノイドを作成した。Step２から、さらに、HUVECとADSCの細胞数比率は１：３で混入し、通常の3D HLCと比較した。形態学的には通常の3D HLCとオルガノイドに変わりなく、sizeもほとんど同じ程度であった。ただし、細胞集塊のViabilityを蛍光免染で評価したところ、3DHLCの方が、部分的に死細胞が存在しているがことがわかり、オルガノイドでは、細胞集塊中心部であっても、Viabilityは良好であった。肝細胞遺伝子発現では、オルガノイドでAATやCPS1などの発現が3D HLCよりもさらに高発現しており、肝細胞機能に関して、CYP3A4活性がオルガノイドで良好であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ADSCからの分化誘導の過程でヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を混入し、オルガノイドを作成した。どのStepからHUVECを混入するべきか予備実験を行い、1）Step1～、2) Step2～、3)Step3～、4)HLC分化誘導後の4群間で肝細胞成熟遺伝子発現を比較した。結果としてStep2からのオルガノイドが最も α1-antitrypsin(AAT)発現が高値であったため、Step２からHUVECを混入した。さらに、HUVECとADSCの細胞数比率は過去の文献結果に基づき（J Hepatolo 2018）１：３で作成した。以下、3D HLCとオルガノイドの2群間で比較検討した。
結果として、形態学的には通常の3D HLCとオルガノイドに変わりなくsizeもほとんど同程度であった。ただし、細胞集塊のViabilityを蛍光免染で評価したところ、3DHLCの方が、部分的に死細胞が存在しているがことがわかり、オルガノイドでは、細胞集塊中心部であっても、Viabilityは良好であった。肝細胞遺伝子発現では、オルガノイドでAATやCarbamoylphosphate synthetase (CPS1)などの発現が3D HLCよりもさらに高発現していた。肝細胞機能に関して、アンモニア代謝能には両群間で、差を認めなかったが、CYP3A4活性はオルガノイドで良好であった。よって、おおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
主に免疫原生の確認、また、代謝性モデルへの移植が当面目標となる。
HLCの臨床応用を考慮した際に、我々が対象とする、代謝性肝疾患患者（尿素サイクル異常症・家族性アミロイドニューロパチー）由来のADSCから作成したHLCが、健常者のHLCと比較して肝細胞機能は不良であることが知られている。尿素サイクル異常症の1つである、アルギナーゼ1欠損症患者のiPS細胞由来HLCのアンモニア代謝は不良であり、iPS細胞の遺伝子操作が必要となることが報告されている（Mol Ther Nucleic Acids. 2016）。Ⅰ型シトルリン血症患者由来のHLCも同様に尿素サイクルは不良であった（Biochem Biophys Res Commun. 2017）。その場合、健常者である他者由来の(allogenic) ADSCからHLCを誘導する場合、どの時点でHLCの免疫抗原性が上昇してくるのかを明らかにする必要がある。
また、我々はOTC KOモデルあるいはⅠ型シトルリン血症モデルマウスをすでに保有しており、3D HLC移植を実施し、血清アンモニア低下を確認している。今回作成したオルガノイドも同モデルに移植予定である。
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