2022 Fiscal Year Annual Research Report
Roles of liquid-liquid phase separation in DNA double-strand break repair
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22H03743
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Meisei University |
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Principal Investigator |
香川 亘 明星大学, 理工学部, 教授 (70415123)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安田 武嗣 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 主幹研究員 (60332269)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 液-液相分離 / DNA二重鎖切断 / DNA修復 / RAD52 / RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Rad52は，酵母からヒトまで真核生物において広く保存されており，DNA二重鎖切断（DSB）損傷を修復する機構ではたらくと考えられている。酵母では，Rad52は修復の初期過程でDSBに集積し，Rad51タンパク質を損傷部位に呼び込んで修復反応を促進する。ヒト培養細胞においてもRAD52はDSB依存的に集積することが示されており，損傷部位へのRAD52の集積はDNA修復機構における重要なステップであることが考えられる。しかし，RAD52が損傷部位に集積する分子機構は不明な点が多い。そこで本研究では，ヒトRAD52がDNA損傷部位に集積する分子メカニズムとして液-液相分離が関与する可能性を検討した。
ヒトRAD52の液滴形成をin vitroで検証するために，RAD52-GFPの大量調製系を確立した。それと並行してRAD52の天然変性領域内のlow complexity配列をアラニンに置換した変異体を複数種類作製し，野生型と同様の方法で液滴形成を検証した。RAD52-GFPを含む溶液はタンパク質凝集剤であるデキストランと混和することで透明な状態から濁った状態に変化した。この溶液にKClを加えると透明な状態に戻ることから，RAD52-GFPの凝集は可逆的であることがわかった。デキストランで凝集させたRAD52-GFPを蛍光顕微鏡で観察したところ，直径1~5 μmの球状の粒子が観察された。粒子を含む溶液に1,6-hexanediolを加えたところ，粒子が消失したことから，RAD52-GFPの液滴は液-液相分離によって形成されたことが強く示唆された。次に，low complexity配列に変異を導入したRAD52-GFPについても同様の解析を行った。その結果，RPA結合領域の近傍に変異を導入したRAD52-GFPにおいて，液滴形成能が野生型と比べ，顕著に低下していることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では2022年度中に，液滴形成に重要なRAD52の領域を同定することになっていたが，in vitroでの解析が予想以上に時間がかかり，in vivoでの解析が進んでいない。2023年度では，協力研究者（大学院生）を増やし，対処する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
【計画1】液滴形成に重要なRAD52のアミノ酸領域を同定
前年度に引き続き，液滴形成に重要なRAD52のアミノ酸領域をin vitroおよびin vivoの解析を組み合わせることで明らかにする。RAD52のC末端側半分の天然変性領域は，液滴の形成に重要であることが考えられる。これを検証するために，RAD52のセリン，グルタミン，グリシン，またはアルギニンが密集するlow complexity領域をアラニンに置換した点変異体や領域を欠いた欠失変異体を複数種類作成し，既に確立済みである試験管内でRAD52の液滴が形成される条件において，液-液相分離に影響がないか調べる。次に，in vitroの解析より得られたアミノ酸領域の情報を元に，液滴形成に影響があったRAD52変異体を発現する細胞株を作製し，二重鎖切断への集積に影響がないか調べる。上記の解析を行うことにより，液滴形成に重要なRAD52のアミノ酸領域が明らかになると考える。
【計画2】液滴とDSB修復経路との関係性を解明
液滴形成に重要であるRAD52のアミノ酸領域を変異させた時に，二重鎖切断修復の経路ごとの効率にどのような影響を及ぼすのかをヒト培養細胞を用いて検証する。 二重鎖切断修復経路であるHR（homologous recombination），BIR（break-induced replication），SSA（single-strand annealing）を検出するGFPレポーターアッセイを用い，RAD52変異体の発現を行った際の各修復経路の効率を調べる。
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