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2016 Fiscal Year Annual Research Report

シアノバクテリアの時計タンパク質による概日時間の生成機構

Research Project

Project/Area Number 24000016
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

近藤 孝男  名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任教授 (10124223)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 秋山 修志  分子科学研究所, 協奏分子システム研究センター, 教授 (50391842)
Project Period (FY) 2013 – 2017
Keywordsシアノバクテリア / KaiCタンパク質 / 概日時計 / ATPase活性制御 / 機械式概日時計モデル / 時間生物学 / 構造生物化学 / 結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements

シアノバクテリアの3つのKai蛋白質はATPとともに混合するだけで安定した24時間周期の概日リズムを示す。その振動の周期や温度補償性は2つのATPaseから構成されるタンパク質KaiCが規定している。本年度はこのタンパク質に埋め込まれた概日時計の運行原理を理解するため、KaiCのもつ2つのATPase活性に着目し、以下のような突然変異体を利用したKaiCのATP分解活性の生化学的解析と構造生物学的解析を行い、その基本的デザインを理解することを目的とした。
(1) タンパク質に潜む安定した概日振動の発生機構をその2つの生化学的活性の協働として解明する。
(2) 生命がいかにして24時間という地球の自転周期をタンパク質分子内に記憶したかをタンパク質構造ベースで理解すること。
(3) 真核生物で同様の可能性をさぐること。
今年度は極めて微弱なKaiCのATPase活性を正確に再現性よく測定するプロトコルを確立し、様々な条件下でその変動を解析することで2つの成分を分別することを可能にした。その結果、サイン波の成分をC1ドメインのATPaseが発生し、C2ドメインのATPaseはリン酸化サイクルに連動した矩形波成分となることを示した。一方、24時間周期のエンコード先を調べるため、蛍光プローブの導入位置が異なる複数のKaiC変異体について、高感度蛍光計測システムを用いた評価を実施した。N末端ドメインにプローブを導入したKaiC変異体を中心に、蛍光強度の概日揺らぎと結晶構造の対応を精査し、KaiCの六量体リング構造の内径側と外径側における構造変化の関係を明らかにした。(3)については研究代表者の療養のため十分な解析ができなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は1日に10~20個のATP分解という極めて低いが安定性の高いATPase活性の解析を中心に研究を展開した。前年度の測定法の改善によりこの活性を再現性良く測定することを可能としたが、測定できるのは2つのATPase活性の和であり、相互作用の解明には分別して測定することが不可欠である。2つの活性を変異導入により調整してそれぞれを測定することが良く行われるが、KaiCの計時機構が相互作用に深く依存している場合には、この方法で分別することはできない。しかし、2つの成分は異なった温度感受性をもつことが期待できるので、我々は様々な温度条件で波形を正確に評価することで2つの成分の分別を試みた。その結果、2つのATPase活性はペースメーカーとして機能する調和振動とリズムの駆動装置としてのリン酸化サイクルを生じる緩和振動として評価できることを示した。この成果データは概日振動の正確な周期発生機構と全体を駆動する振動発生機構を説明することが可能で、概日時計のデザインについて新たなモデルを提案することとなった(現在論文準備中)。
一方、平成28年度までの研究活動を通して、N末端ドメイン(CI)の高分解能X線結晶構造解析を実施し、KaiCの固有振動数と密接に関係しているATPase活性の制御機構について詳しく検証してきた。結晶中での構造変化が、より生理的な溶液中におけるKaiCのリズミックな運動とどのように対応するかを調べるため、KaiCの高感度蛍光計測を実施した。その結果、6量体リング内径側でATP加水分解に連動した主要な構造変化が起こる一方で、外径側はATP近傍の小規模な構造変化にとどまることが明らかとなり、結晶構造解析から示唆されていたATP加水分解機構を支持する内容であった。
これらの成果は本研究の主要な2つの目的に対し大きな進展をもたらしたものであり、研究は順調に進展していると考えられる

Strategy for Future Research Activity

28年度には研究代表者の予期せぬ療養のため研究計画の一部が遂行出来なかった。幸いに今後は回復が期待できるので、経費の一部を繰越し29年度に継続する。さらに29年度以降の研究経費も認められているので、特別推進研究の成果をさらに進めたい。
29年度はこれまでの成果をさらに進展させ、概日時計の最終解答を得るべく、以下の研究を計画している。
(1) これまでの特別推進研究からKaiC ATPaseが機械時計のようにペースメーカーとリン酸化リズムドライバーおよび脱進器機構により構成されているとする仮説を示すデータを得ることができた。今後はこれまでに確立した2つのATPase活性の分別して解析する方法をKaiC変異体に積極的に活用し、このモデルの検証を進める。さらにCCDカメラを利用したスクリーニングで作用機構の変異体を利用して、検証のための解析を行う。
(2) C末端ドメインにプローブを導入したKaiC変異体を中心に、プローブ導入位置(全長KaiCの結晶構造)、発振周期、蛍光リズムの振幅、これら3者の対応関係を精査する。
(3) 細胞内におけるKaiC分子時計の機能を明らかにするため、KaiC時計で見出した6量体間での同期機構についてさらに解析を進る。6量体としての同期機構の解明は細胞内機能解明のみならず基本計時機構の解明としても重要である。
(4) 真核生物の時計についても引き続き探索を続けたい。方針については、様々なインフォマティクスの専門家との検討も更に進めたい。スクリーニング条件、あるいは複数の遺伝子のヘテロ複合体が関与する場合はさらに複雑な検討が必要である。また、哺乳類の概日時計研究者と共同研究を進め、真核生物での検定を進める予定である。

  • Research Products

    (33 results)

All 2017 2016

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 3 results) Presentation (28 results) (of which Int'l Joint Research: 13 results,  Invited: 9 results) Funded Workshop (1 results)

  • [Journal Article] Accelerating in vitro studies on circadian clock systems using an automated sampling device2016

    • Author(s)
      Furuike Y., Abe J., Mukaiyama A., Akiyama S.*
    • Journal Title

      Biophysics and Physicobiology

      Volume: 13 Pages: 235-241

    • DOI

      10.2142/biophysico.13.0_235

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] 概日時計因子の構造や動態を調べる意義とは?2016

    • Author(s)
      秋山 修志*
    • Journal Title

      生物物理

      Volume: 56 Pages: 266-270

    • DOI

      10.2142/biophys.56.266

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] シアノバクテリアの概日時計タンパク質KaiCによる計時機構2016

    • Author(s)
      伊藤(三輪)久美子, 村中智明, 近藤孝男*
    • Journal Title

      生体の科学

      Volume: 67 Pages: 507-511

    • DOI

      10.11477/mf.2425200541

  • [Journal Article] Absolute slowness encoded in the circadian clock protein KaiC.2016

    • Author(s)
      Abe J., Mukaiyama A., Akiyama S.*
    • Journal Title

      SPring-8 Research Frontiers 2015

      Pages: 24-25

    • Open Access
  • [Presentation] シアノバクテリア時計タンバク質KaiCの一分子観察2017

    • Author(s)
      阿部 淳、向山 厚、古池 美彦、山下 栄樹、近藤 孝男、秋山 修志
    • Organizer
      平成28年度 日本生物物理学会中部支部講演会
    • Place of Presentation
      名古屋大学東山キャンパス ES総合館1階ESホール
    • Year and Date
      2017-03-06
  • [Presentation] 生物の不思議 ~体内時計~2017

    • Author(s)
      秋山 修志
    • Organizer
      日本放射光学会市民公開講座
    • Place of Presentation
      神戸芸術センター
    • Year and Date
      2017-01-08
    • Invited
  • [Presentation] The ATPase-based circadian pacemaker in KaiC2017

    • Author(s)
      Tomoaki Muranaka, Kumiko Miwa, Takao Kondo
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Escapement mechanism in a cyanobacterial clock protein KaiC2017

    • Author(s)
      Kumiko Miwa, TomoakiMuranaka, Takao Kondo
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Principle of circadian clock by KaiC protein of cyanobacteria2017

    • Author(s)
      Takao Kondo
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] The basicdesign of the cyanobacterial circadian clock protein KaiC2017

    • Author(s)
      Saki Oota, Kumiko Ito-Miwa, Tomoaki Muranaka, Takao Kondo
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Function of KaiA and KaiB in the ATPase Activity Rhythm of KaiC2017

    • Author(s)
      Yoshino Imura, Tomoaki Muranaka, Kumiko Ito, Michio Homma, Takao Kondo
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Biological X-ray Solution Scattering Activities at the Institute for Molecular Science2017

    • Author(s)
      Akiyama S.
    • Organizer
      Okazaki Conference 2017 on Grand Challenges in Small-angle Scattering
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Atomic-scale origins of slowness and temperature compensation in KaiC2017

    • Author(s)
      Akiyama S.
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Visualizing a ring-shaped structure of KaiC at single-molecule levels2017

    • Author(s)
      Abe J., Mukaiyama A., Furuike Y., Yamashita E., Kondo T., Akiyama S.
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Characterizing the conformational chang of the C1 ring in solution2017

    • Author(s)
      Mukaiyama A., Abe J., Furuike Y., Yamashita E., Kondo T., Akiyama S.
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Functional and Structural Study on Peptide Isomerization in KaiC2017

    • Author(s)
      Furuike Y., Abe J., Mukaiyama A., Yamashita E., Kondo T., Akiyama S.
    • Organizer
      Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] シアノバクテリア時計タンパク質KaiCにおける主鎖異性化反応の意義2017

    • Author(s)
      古池美彦、阿部淳、向山厚、山下栄樹、近藤孝男、秋山修志
    • Organizer
      平成28年度 日本生物物理学会中部支部講演会
  • [Presentation] 蛍光分光法による時計タンパク質KaiCの動的構造変化の解析2017

    • Author(s)
      向山 厚、阿部 淳、古池 美彦、山下 栄樹、近藤 孝男、秋山 修志
    • Organizer
      平成28年度 日本生物物理学会中部支部講演会
  • [Presentation] シアノバクテリア時計タンパク質KaiCの一分子観察2016

    • Author(s)
      阿部 淳、向山 厚、古池 美彦、秋山 修志
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
    • Place of Presentation
      名古屋大学豊田講堂
    • Year and Date
      2016-11-12
  • [Presentation] Escapement mechanism in a cyanobacterial clock protein KaiC2016

    • Author(s)
      Kumiko Ito-Miwa, Tomoaki Muranaka and Takao Kondo
    • Organizer
      IGER International Symposium on Biological Rhythms “Towards understanding the molecular clockwork”
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] The period determining ATPase activity of KaiC2016

    • Author(s)
      Tomoaki Muranaka, Kumiko Ito-Miwa, Takao Kondo
    • Organizer
      IGER International Symposium on Biological Rhythms “Towards understanding the molecular clockwork”
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 時計タンパク質KaiCの特定部位のアミノ酸側鎖の大きさが周期を決める2016

    • Author(s)
      伊藤 久美子、村中 智明、近藤 孝男
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
  • [Presentation] KaiCに備わる2つのATPaseの機能推定2016

    • Author(s)
      村中智明、伊藤久美子、伊村芳野、近藤孝男
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
  • [Presentation] KaiC in vitro oscillatorの周期はpH依存的に変化する2016

    • Author(s)
      太田早紀、伊藤久美子、村中智明、本間道夫、近藤孝男
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
  • [Presentation] KaiCのATPase活性リズム形成におけるKaiAとKaiBの機能推定2016

    • Author(s)
      伊村芳野、村中智明、伊藤久美子、本間道夫、近藤孝男
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
  • [Presentation] Cyanobacterial circadian clock system. How and why can it be so slow and stable?2016

    • Author(s)
      Akiyama S.
    • Organizer
      Sapporo Symposium on Biological Rhythm
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 生体分子システム研究に必要なツールとは?2016

    • Author(s)
      秋山 修志
    • Organizer
      中性子生命科学研究会
    • Invited
  • [Presentation] AFM observation of a ring-shaped structure of KaiC2016

    • Author(s)
      Abe J., Mukaiyama A., Furuike Y., Akiyama S.
    • Organizer
      The 54th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • [Presentation] 蛍光分光法を用いた時計タンパク質KaiCの動的構造変化の解析2016

    • Author(s)
      向山 厚、阿部 淳、古池 美彦、山下 栄樹、近藤 孝男、秋山 修志
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
  • [Presentation] KaiCにおける主鎖異性化反応の意義2016

    • Author(s)
      古池美彦、阿部淳、向山厚、山下栄樹、近藤孝男、秋山修志
    • Organizer
      第23回日本時間生物学会学術大会
  • [Presentation] Structural Differences between Phosphorylated and Dephosphorylated States of Clock Protein KaiC2016

    • Author(s)
      Furuike Y., Abe J., Yamashita E., Kondo T., Akiyama S.
    • Organizer
      The 54th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • [Presentation] Spectroscopic characterization of the conformational change of the cyanobacterial clock protein KaiC2016

    • Author(s)
      Mukaiyama A., Abe J., Furuike Y., Yamashita E., Kondo T., Akiyama S.
    • Organizer
      The 54th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • [Funded Workshop] Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-20172017

    • Place of Presentation
      Nagoya University
    • Year and Date
      2017-03-11 – 2017-03-12

URL: 

Published: 2018-01-18  

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