2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24227005
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
安藤 敏夫 金沢大学, 数物科学系, 教授 (50184320)
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| Project Period (FY) |
2012-05-31 – 2017-03-31
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| Keywords | 構造生物 / 1分子計測・操作 / バイオイメージング / タンパク質 / 細胞 / 走査プローブ顕微鏡 / ダイナミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本プロジェクト前の研究で得られた成果をベースに以下の3つの課題に取り組んできた。①分離精製されたタンパク質分子の機能動態を撮影し、その動画映像からそれらタンパク質の詳細な機能メカニズムを解明する、②生きたバクテリアや真核細胞、分離調製された細胞内オルガネラのような大きな試料系の高速AFM観察を可能とする技術開発を行い、その性能を実証する、③極めて柔らかい生きた真核細胞表面で起こる動的現象を、非接触で高解像イメージングできる高速SICMを開発し、その性能を実証する。
平成26年度における研究実施内容と成果は以下の通り。
①タンパク質の機能動態撮影：多くのタンパク質系の観察実験と新しい観察対象の探索・試料調製を進めた。コフィリンとアクチン線維との相互作用、キネシンの一種であるセントラルスピンドリンの構造、キチナーゼの酵素反応に伴う運動などの成果を論文に発表した。インターラクティブ高速AFMをミオシンＶに適用して得られた画期的な成果、天然変性タンパク質で見出した天然変性領域に関する一般則を利用して、残基レベルで領域同定できることを示した成果などについては、論文執筆を進めた。H27年度に投稿予定である。
②細胞などの大きな系で起こる動態を観察するための技術開発：高速・広域走査技術は既に完成させている。また、機能拡張性の高い探針走査型高速AFMが完成に近づいたことから、実際の機能拡張に向け、まず蛍光顕微鏡との複合システムを組み上げ、高速AFM像と１分子蛍光像の同時取得が可能であることを実証した。細胞動態の観察も行い、論文に発表した。
③高速SICMの開発：前年度までにイオン電導計測の高速化と低ノイズ化を実現したため、H26年度はプローブであるガラスキャピラリを高速走査するスキャナーの開発を進めた。その結果、高速AFM走査性能に匹敵する高速走査性能を実現できた。現在論文執筆中。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1. 広域高速スキャナーの開発は予定よりも早く完了し、すでに実証のためのイメージング研究も済んでいることから、本格的な応用研究に着手する段階にある。従って、予定以上の成果が見込まれる。
2. 探針走査型高速AFMの開発も予定よりも早く進展し、全反射蛍光顕微鏡と融合させて、高速AFM像と1分子蛍光像の同時取得が既に実現された。従って、この高速AFM装置に新しい技術を導入するという当初の予定を超えた新しい技術開発に着手できるようになった。従って、予定を超える成果が見込まれる。
3. インターラクティブ高速AFMの開発は当初の予定になかったものであるが、このアイデアを発案し、高速AFMのプログラムを一部書き換え、回路系を一部変更するだけでインターラクティブ動作を実現した。この新技術を用いて、ATP-freeのMyosin Vの歩行運動という画期的な発見をした。これは予想を超える大きな成果である。
4. 非常に挑戦的で困難が予想された高速SICMの開発であったが、イオン伝導計測の帯域は既に従来の100倍に拡大し、且つ、この広帯域であってもS/N比は従来の20倍程度にまで既に改善され、高感度性能及び高解像性能を有する高速SICMの実現がほぼ確かなものとなった。それ故、予定以上の成果が見込まれる。高速SCIMの実現は対象を選ばずにIn situ動画イメージングを可能にするという点で、大きなインパクトがあり、その生命科学への貢献は高速AFMを凌ぐ可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予想を超える成果が得られていることから、当初の計画を見直し新たな構想を構築して研究を進めるべき段階にある。それ故、終了年度前申請も検討する。
①広域を走査可能な高速AFM：装置は完成しており、細胞のイメージングによる装置性能の実証研究も完了している。試料が極めて柔らかくない限り、その表面で起こる動的分子プロセスを観察可能である。装置性能の実証レベルを超えて、本格的応用研究に入る時期に既に来ていると考えている。そこで、ミトコンドリアと核の表面で起こる動的分子プロセスの観察に挑戦する。表面が極めて柔らかくイメージングが困難な場合には、高速SICMの完成を待つ。
②探針走査型高速AFM：装置はほぼ完成していることから、予定を変更して、機能拡張に向けて以下の具体的な技術開発を進める計画である。(i)マニュピレータを導入し、外力作用下にあるタンパク質分子の観察を実現する。(ii)Nanoporeを利用して膜の表裏間に電圧を掛けられるようにすることなどにより、電位依存的に活性化するチャネルタンパク質や輸送膜タンパク質系の動態観察への道を拓く。
③高速SICM：イオン伝導計測の高速化とS/N比の向上のための開発は完了し、プローブであるガラスキャピラリを走査するスキャナー、及び、光学顕微鏡観察も同時に行えるようにデザインしたXYスキャナーの開発もほぼ完了しているため、1年以内に装置全体の製作を完了できると見込まれる。従って、細胞内オルガネラや細胞を対象にして装置性能を実証するイメージング研究を残る期間内で実施する。
④これまでに行ってきた分離精製したタンパク質分子系の高速AFM観察の成果をまとめ、論文として発表する。
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| Remarks |
Modified atomic force microscope allows for high-speed high-res imaging of live neurons
http://www.kurzweilai.net/modified-atomic-force-microscope-allows-for-high-speed-high-res-imaging-of-live-neurons
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Research Products
(44 results)
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[Journal Article] Multiple Interactions of the Intrinsically Disordered Region between the N-terminal Helicase and C-terminal Nuclease Domains2014
Author(s)
S. Ishino, T. Yamagami, M. Kitamura, N. Kodera, T. Mori, S. Sugiyama, T. Ando, N. Goda, T. Tenno, H. Hiroaki, and Y. Ishino
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 289
Pages: 21627-21639
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Single-molecule imaging analysis of elementary reaction steps of Trichoderma Reesei cellobiohydrolase I (Cel7A) hydrolyzing crystalline cell2014
Author(s)
Y. Shibafuji, A. Nakamura, T. Uchihashi, N. Sugimoto, S. Fukuda, H. Watanabe, M. Samejima, T. Ando, H. Noji, A. Koivula, K. Igarashi, and R. Iino
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 289
Pages: 14056-14065
DOI
Peer Reviewed
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