2012 Fiscal Year Annual Research Report
アミノ基修飾型キャリアタンパク質を介した物質変換機構の解明と応用展開
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24228001
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Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西山 真 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (00208240)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 武郎 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教 (50447364)
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| Project Period (FY) |
2012-05-31 – 2017-03-31
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| Keywords | キャリアタンパク質 / リジン生合成 / アルギニン生合成 / 好熱性細菌 / 古細菌 / 進化 / アミノ酸生合成 / 結晶構造 |
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| Research Abstract |
Thermus thermophilusのリジン生合成においては、LysWがAAAのアミノ基に結合したまま、AAAの側鎖が変換され反応が進行する。各生合成酵素のLysW認識様式を明らかにするために、LysW単体およびLysWとLysZとの複合体の結晶構造解析を行った。現在最終構造の精密化を行っている。また、古細菌Sulfolobus acidocaldariusにも同様なlysWを含む遺伝子クラスターが見出されるが、基質のアミノ基をLysWで保護修飾するLysXホモログが２つ存在する。それらの機能をin vitroおよびin vivoで解析した結果、Saci_0754がLys生合成のLysXとして、Saci_1621がArg生合成のArgXとして機能することが分かった。ArgXとLysWの複合体の結晶構造を決定すると共に、それ以外のリジン生合成酵素がアルギニン生合成にも関わることを明らかにした。我々は放線菌にもlysW-lysXのホモログが存在することを見出している。放線菌はDAP経路によりリジンを生合成することが知られているため、見出されたリジン生合成酵素類似のクラスターは二次代謝産物の生合成に関わるものと推測された。そこでlysW、lysX、lysZ、lysYなどのホモログを有するStreptomyces sp. SANK 60404を対象とし、LysXホモログがLysWホモログにどのような化合物を結合させるかを明らかにすることを目的として、次の反応を触媒するlysZホモログの破壊株を作製した。同破壊株からLysWを精製し、LysWに結合している化合物の構造をMS/MSを用いてたところ、Ｃ末端にはグルタミン酸が付加していることが明らかとなった。現在、LysW上でさらにどのような修飾を受けるかを明らかにするため、異種生産系を確立し、生成物の構造決定を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね順調に進展している。１）現在までに論文発表の形態には至ってはいないが、Thermus thermophilusのLysZ(Saci_0751)とキャリアタンパク質LysW(Saci_0753)の複合体構造やLysW-AAA単体の結晶構造の決定に成功している。２）古細菌Sulfolobus acidocaldariusに存在する類似の遺伝子クラスターがリジン生合成と同時にアルギニン生合成をも担うことを明らかにすることに成功した。そうした中でキャリアタンパク質LysWに基質を付加するLysXホモログが同菌には２つ存在することを見出し、Saci_0754、Saci_1621それぞれが、Lys生合成のLysX、アルギニン生合成のArgXとして機能することをin vitroおよびin vivoから証明した。さらにはArgXとLysW、ADP、グルタミン酸、硫酸イオン複合体の結晶構造を高分解能で決定することに成功した。これらはアミノ基付加型キャリアタンパク質、及びそれと生合成酵素の結晶構造を世界で初めて決定した成果となる。３）放線菌のLysWホモログが関わる二次代謝については、LysXホモログがin vitroでキャリアタンパク質ホモログにグルタミン酸を付加することは見いだせたが、これが本当の生合成機構に含まれるかは分からなかった。そこで次の反応を触媒するLysZホモログの破壊株を作製した結果、少量ではあるがLysWホモログの誘導体が得られ、確かにグルタミン酸が付加していることを確認できた。次にLysWホモログから切り離される最終構造についても同様の破壊株を用いた手法で解析を行った。やはり少量しか得られないため、精密構造を決定することは非常に困難であった。しかし、異種発現系による大量生産系が確立されつつあり、二次代謝生合成の最も重要な部分のブレークスルーとなると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
T. thermophilusのリジン生合成については、LysZによるキャリアタンパク質LysWの認識機構の詳細が明らかになりつつある。引き続き他の生合成酵素との複合体構造決定を行っていくことで、その全貌が明らかになるものと期待している。また、Thermococcus kodakarensisにおいては、同様にリジンが生合成されると考えられるものの、S. acidocaldariusとは異なり、LysXホモログが１種類しか存在せず、これがリジン、アルギニン生合成の両方を担うことが予想されるため、以降の生合成酵素も含めてこれらが本当に両方のアミノ酸生合成に関わることを調べる。基質の二重認識の分子基盤を明らかにするためにこれらの酵素の結晶構造を明らかにすることを是非必要であるため、様々な条件での結晶化を試す。S. acidocaldariusやT. kodakarensisでは遺伝子操作系、遺伝子破壊系が報告されているが、申請者の研究室ではそれが上手く動いていない、まずはS. acidocaldariusについてドイツマックスプランク研究所にて手法を習得予定である。T. kodakarensisについては、日本国内で系が確立されているため、必要に応じて系の導入を検討する予定である。放線菌については、LysWホモログが関わる二次代謝の最終産物の同定が必須である。生合成中間体の構造決定には成功できるものと考えているが、最終構造については生産量が少ないことがネックとなる可能性がある。そこで、最近放線菌で利用可能になってきたBACクローンを用いて異種放線菌での発現を行うことが必要と考えている。最終産物は何らかの生物活性を示すことが期待される。生物への活性検定ついては興味を示す研究者、産業界などと共に行っていきたい。
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