2012 Fiscal Year Annual Research Report
オプチニューリン機能異常を基盤としたALSの発症機序解明と新規治療候補薬の開発
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24300132
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
伊東 秀文 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20250061)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河本 恭裕 京都大学, 医学研究科, 非常勤講師 (40335253)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | オプチニューリン / 筋萎縮性側索硬化症 / NF-кB / ゴルジ装置断片化 / 炎症性サイトカイン |
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| Research Abstract |
1)OPTN遺伝子改変細胞を用いた解析
培養細胞(Neuro2a細胞)を用いて、siRNAによるOPTNのノックダウンを行った。結果、siRNAを導入した細胞では、ウェスタンブロットでのOPTNの消失が確認され、ルシフェラーゼ活性でのNFκBパスウェイが亢進していることを確認した。さらに、細胞死を確認したところ、トリパンブルーアッセイにおいて、細胞死が上昇していることを確認した。この細胞死はOPTNKD細胞に野生型OPTNを強制発現することで抑制されることも確認した。.
2)OPTN関連蛋白の局在異常の検討
OPTN変異ALS症例、孤発性ALS症例、OPTN遺伝子改変細胞においてRIP-1,huntingtin,MyoVI,HAP1,dynactinなどに対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行ったが、いずれも有意な所見が得られなかった。これは抗体の質に問題があると考えられた。一方、NFκBのサブユニットであるp65の免疫染色による検討を行ったところ、OPTN変異の症例では、優性例(E478G)、劣性例(Q398X)の剖検例ともアセチル化されたp65が細胞質に凝集体を形成している像が観察された。また、孤発性ALSや他の変異例(VCP遺伝子の変異例)でも同様に細胞質に凝集していることが観察され、病態を共有していることが示唆された。
3)OPTN-ALS患者における炎症性サイトカインの測定
OPTN-ALS患者から採取したfibroblastを二重鎖RNA(poly I:C)で刺激して培養して、培養上清中のインターフェロンβをELISAで測定して健常人と比較したところ、ALS480E478Gホモ>ALS484E478G>健常人由来fibroblastの順でIFN-βが誘導された。この結果より、患者検体においてIFN-βの産生が亢進している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書の平成24年度研究実施計画に記載した実験はすべて行ったため、実施の達成度は100%である。
すべての実験で意義のある結果が得られたわけではないが、約70%の実験で有意ないし有望な結果が得られたため、平成25年度以降の実験に1頂調に移行できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画は現在のところ順調に進展しており、特に変更や課題はない。今後も研究計画に沿って実験を遂行していく予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度は多数のモデル動物や多数例の孤発性ALS患者脳においてOPTN関連タンパクの局在を網羅的に明らかにする計画のため、大量の免疫染色が必要である。そのため、免疫組織化学に用いる一次抗体やその他の試薬、ガラス器具などの消耗品に使用する予定である。平成24年度の実験で有意な結果が得られなかった項目は、使用した一次抗体の質に問題があったと考え、よりよい抗体を検索したが、有望なものが見つからなかったため、購入を断念し、次年度以降によりよい抗体が開発されることを期待して繰り越しを行った。
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[Journal Article] Motor Neuron-specific Disruption of Proteasomes, but Not Autophagy, Replicates Amyotrophic Lateral Sclerosis.2012
Author(s)
Tashiro y Urushitani M, Inoue H, Koike M, Uchiyama y Komatsu M, Tanaka K, Yamazaki M, Abe M, Misawa H, Sakimura K, Ito H, Takahashi R.
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Journal Title
J Biol Chem.
Volume: 287
Pages: 42984-94
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem Cells.2012
Author(s)
Egawa N, Kitaoka S, Tsukita K, Naitoh M, Takahashi K, Yamamoto T, Adach F, Kondo T, Okita K, Asaka I, Aoi T, Watanabe A, Yamada Y, Mmorizane A, Takahashi J, Ayaki T, Ito H, Yoshikawa K, Yamawaki S, Suzuki S, Watanabe D, Hioki H, Kaneko T, Makioka K, Okamoto K, Takuma H, Tamaoka A, Hasegawa K, Nonaka T, Hasegawa M, Kawata A, Yoshida M, Nakahata T, Takahashi R, Maruchetto MC, Gage FH, Yamanaka S, Inoue H.
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Journal Title
Sci Transl Med.
Volume: 4
Pages: 145ra104
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Valosin Containing Protein遺伝子に新規変異を認めた筋萎縮性側索硬化症・Paget病の剖検例2012
Author(s)
綾木孝, 伊東秀文, 近藤孝之, 福島裕子, 井上健, 池本明人, 中野智, 藤田拓司, 山下博史, 猪原匡史, 松本理器, 川又純, 高橋良輔
Organizer
第53回 日本神経学会学術大会
Place of Presentation
東京国際フォーラム
Year and Date
2012-05-25
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