タンパク質導入系LENAによる安全な分化・脱分化誘導法の確立

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24310146
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka Prefectural Institute of Public Health
• Principal Investigator: 駒野 淳 大阪府立公衆衛生研究所, 感染症部, 主任研究員 (60356251)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武田 哲 国立感染症研究所, エイズ研究センター, 研究員 (50396959)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 移植・再生医療 / バイオテクノロジー / レンチウイルス様ナノ粒子 / 脱分化法 / ナノバイオ

Research Abstract

我々はレトロウイルス基礎研究をもとにレンチウイルス様ナノ粒子(Lentivirus-like nanoparticle,LENA)を用いたタンパク質デリバリー法を開発した。iPS細胞を利用した再生医療において、治療用細胞の悪性化やウイルスベクターの混入には大きな懸念がある。これを払拭するにはタンパク質デリバリー法は最適である。本研究ではLENA技術をコアとして既法で得られるものより格段に安全性の高いiPS細胞を樹立する方法を確立する。
概念検証を行うため、本年度はOct3/4によるヒト繊維芽細胞からCD45^+細胞への脱分化誘導能の検証を試みた。Oct3/4導入用LENA発現ベクターを構築して、293T細胞からOct3/4-LENAを調整した。粒子内におけるOct3/4の安定性をイムノブロット法にて検証した。LENA系によるヒト繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化誘導を試みたが、CD45^+細胞への脱分化は検出されなかった。Oct3/4の転写因子機能を検証するためOct3/4活性を検出するレポータープラスミドを一過性に導入したHeLa細胞にOct3/4-LENAを暴露し、経時的にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、転写活性は検出限界以下となった。本実験系を繰り返し施行する中で、LENAによる活性のある転写因子の細胞内導入には鋭敏かつ安定なレポター系の作出とそれに基づく適切なLENA産生プロトコルおよび暴露プロトコルの評価が重要である事が明らかになった。これはLENA法を他の脱分化誘導因子に適応拡大し、LENA系によるヒト繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化誘導を行う上で極めて重要な基盤情報となる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度はOct3/4導入用LENAによる概念検証実験として、Oct3/4導入用LENAの調整とタンパク質導入能の検証とOct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングの検証を企図していたが、転写因子の活性検出において実験系を改善すべきである事が判明したため、これに注力した事が研究計画の推進に影響している。

Strategy for Future Research Activity

LENAによる転写因子活性導入の効率を測定する実験系の改良を行い、LENA産生プロトコルおよび暴露プロトコルの最適化を第一の目標とする。具体的なOct3/4導入によるエフェクター効果を検出する鋭敏且つ定量的な方法として、signaUnoise比が高いレポーターHeLa細胞株を樹立しluciferase reporter活性の検出を試みると同時に、RT=PCRによる内在性Oct3/4標的遺伝子発現誘導を評価する。これを確立した上で再度Oct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングの検証を行い、他の脱分化誘導因子に適応拡大する。ベクター系と物理的なLENA含有転写因子の安定性評価系が確立したので、他の脱分化因子Sox2、H-f4、c-Mycへの適応拡大の第一段階として各因子を含有するLENAの構築を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

直接経費次年度使用額は物品費として計上し、円滑な研究推進に供する。

Research Products

• [Journal Article] Novel role of HSP40/DNAJ in the regulation of HIV-1 replication (2013)
  • Author(s): Urano E, Morikawa Y, Komano J
  • Journal Title: JAIDS Volume: (In press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel therapeutic molecule against HTLV-1 infection targeting provirus. (2013)
  • Author(s): Tanaka A, Takeda S, Kariya R, Matsuda K, Urano E, Okada S, Komano J
  • Journal Title: Leukemia Volume: (In press)
  • DOI: DOI:10.1038/leu.2013.46.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prevalence and epidemiological traits of HIV infections in populations with high risk behaviors as revealed by genetic analysis of HBV. (2013)
  • Author(s): Kojima Y, Kawahata T, Mori H, Furubayashi K, Taniguchi Y, Iwasa A, Taniguchi K, Kimura H, Komano J
  • Journal Title: Epidemiology and Infection. Pages: 1-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Both humoral and cellular immunities to HIV-1 envelope l glycoprotein are elicited by combined immunization with Sendai virus and replication-competent Vaccinia virus vectors and are boosted by CD40Lm. (2012)
  • Author(s): Zhang X, Sobue T, Isshiki M, Makino S, Inoue M, Kato K, Shioda T, Ohashi T Komano J Hanabusa H, Shida H.
  • Journal Title: PLOS ONE. Volume: 7 Pages: e51633
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0051633.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toll-like receptor (TLR) 3 as a potential sensor of retroviral infection in human cells. (2012)
  • Author(s): Miyauchi K, Urano E, Takeda S, Murakami T, Okada Y, Cheng K, Yin H, Kubo M, Komano J
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 12 Pages: 109-116
  • DOI: DOI:10.1016/j.bbrc.2012.06.148.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Regulation of Cyclin T1 expression and function by an alternative splice variant that skips exon 7 and contains a premature termination codon. (2012)
  • Author(s): Urano E, Miyauchi K, Ichikawa R, Futahashi Y, Komano J
  • Journal Title: Gene. Volume: 505 Pages: 1-8
  • DOI: DOI:10.1016/j.gene.2012.06.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunod eficiency virus-1 (2012)
  • Author(s): Saitoh T, Komano J, Saitoh Y, Misawa T, Takahama M, Kozaki T, Uehata T, Iwasaki H, Omori H, Yamaoka S, Yamamoto N, Akira S.
  • Journal Title: Cell Host Microbe. Volume: 12 Pages: 109-116
  • DOI: DOI:10.1016j.chom.2012.05.015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural modulation study of inhibitory compounds for RNase H activity of HIV-1 reverse transcriptase. (2012)
  • Author(s): Yanagita H, Fudo S, Urano E, Ichikawa R, Ogata M, Yokota M, Murakami T, Wu H, Chiba J, Komano J,Hoshino T
  • Journal Title: Chem Pharm. Bull (Tokyo). Volume: 60 Pages: 764-771
  • DOI: DOI:10.1016/j.chom.2012.05.015.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Evaluation of a synthetic C34 trimer of HIV-1 gp41 as AIDS vaccines. (2012)
  • Author(s): Hashimoto C, Nomura W, Ohya A, Urano E, Miyauchi E, Narumi T, Aikawa H, Komano JA, Yamamoto N, Tamamura H.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem. Volume: 12 Pages: 3287-3291
  • DOI: DOI:10.1016/j.bmc.2012.03.050.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Therapeutic potential of HIV protase-activable CASP3. (2012)
  • Author(s): Miyauchi K, Urano E, Takizawa M, Ichikawa R, Komano J
  • Journal Title: Scientific Reports. Volume: 2 Pages: 359
  • DOI: DOI:10.1038/srep00359.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Synthetic C34 Trimer of HIV-1 gp41 Shows Significant Increase of In hibition Potency. (2012)
  • Author(s): Nomura W, Hashimoto C, Ohya A, Miyauchi K, Urano E, Tanaka T, Narumi T, Nakahara T, Komano J, Yamamoto N, Tamamura H
  • Journal Title: ChemMedChem. Volume: 7 Pages: 546
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Therapeutic potential of an artificial endonuclease against HTLV-1 infection (2012)
  • Author(s): 駒野淳, 武田哲, 田中淳
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 20121211-20121214
• [Presentation] DNA J/HSP40 Co-chaperone familyによるHIV-1複製抑制メカニズムの解析 (2012)
  • Author(s): 駒野淳, 浦野恵美子
  • Organizer: 第25回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20121124-20121126
• [Presentation] 弱毒ワクシニアプライム、センダイウイルスブーストエイズワクチン法の免疫評価およびhCD40Lmアジュバント効果の検討 (2012)
  • Author(s): 張険峰, 祖父江友芳, 一色真央, 牧野俊, 井上誠, 加藤和則, 塩田達夫, 大橋貴, 駒野淳, 花房秀次, 志田壽利
  • Organizer: 第25回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20121124-20121126
• [Presentation] ペプチドミメティック型インテグラーゼ阻害剤の構造活性相関研究 (2012)
  • Author(s): 相川春夫, 松本大地, 野末愛美, 浦野恵美子, Mathieu Metifiot, Maddali Kasthuraiah, 野村渉, 鳴海哲夫, 駒野淳, 村上努, Pommier Yves, 山本直樹, 玉村啓和
  • Organizer: 第25回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20121124-20121126
• [Presentation] 再生医療によるHIV/AIDS遺伝子細胞治療法の開発に向けた技術基盤の構築 (2012)
  • Author(s): 武田哲, 駒野淳
  • Organizer: 第59回日本ウィルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20121113-20121115
• [Presentation] HTLV-1プロウイルスを物理的に傷害する人工酵素の開発 (2012)
  • Author(s): 駒野淳, 田中淳, 武田哲
  • Organizer: 第59回日本ウィルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20121113-20121115
• [Presentation] プロウイルスの物理的障害によるHTLV-1感染細胞増殖の抑制 (2012)
  • Author(s): 武田哲, 田中淳, 駒野淳
  • Organizer: 第59回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20121113-20121115
• [Presentation] HBV感染者における新規Ae/GリコンビナントHBVの解析 (2012)
  • Author(s): 小島洋子, 川畑拓也, 森治代, 駒野淳, 谷口恭, 井戸田一朗
  • Organizer: 第59回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20121113-20121115
• [Presentation] ヒト化マウスを用いたEBウイルス関連リンパ増殖性疾患に対する免疫細胞治療のモデル実験 (2012)
  • Author(s): 松田剛, 今留謙一, 矢島美彩子, 落合央, 望月雅司, 川野布由子, 山田千尋、今井由美, 濱崎霞, 浅田恵理子, 原口摩耶, 千葉祐規乃, 清水則夫, 駒野淳、, 山本直樹, 藤原成悦
  • Organizer: 第59回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 20121113-20121115
• [Presentation] A novel therapeutic molecule that irreversibly disrupts the HTLV-1 provirus (2012)
  • Author(s): J Komano, A Tanaka, S Takeda, R Ichikawa, E Urano
  • Organizer: 第71回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 20120919-20120921
• [Presentation] P-TEFb複合体機能調節因子群によるHTLV-1転写制御メカニズムの解析 (2012)
  • Author(s): 浦野恵美子, 木村雄一, 駒野淳
  • Organizer: 第5回HTLV-1研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20120825-20120826
• [Presentation] Proliferative inhibition of ATL-derived and HTLV-1-transformed human Tcells by an artificial restriction (2012)
  • Author(s): 駒野淳, 田中淳, 武田哲
  • Organizer: 第5回HTLV-1研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20120825-20120826
• [Presentation] Toll-like receptor(TLR)3 as a potential sensor of retroviral nfection in human cell (2012)
  • Author(s): K Miyauchi, E Urano, S Takeda, T Murakami, Y Okada, K Cheng, H Yin, M Kubo, J Komano
  • Organizer: CSHL meeting on Retroviruses
  • Place of Presentation: Cold Spring Harbor, NY, USA
  • Year and Date: 20120521-20120526
• [Presentation] Non-coding RNA(7SK)の転写抑制機能を模倣したRNAモチーフの探索 (2012)
  • Author(s): 山吉麻子, 岸本恭介, 林里依, 駒野淳, 小柳義夫, 小堀哲生, 村上章
  • Organizer: 第58回高分子研究発表会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2012-07-13
• [Presentation] 安全な細胞内免疫を可能にする治療分子の開発に関する研究 (2012)
  • Author(s): 駒野淳, 浦野恵美子, 宮内浩典, 市川玲子, 滝沢真理
  • Organizer: 第26回近畿エイズ研究会・学術集会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2012-01-07
• [Patent(Industrial Property Rights)] HIV立体構造認識抗体誘導ペプチド (2012)
  • Inventor(s): 玉村啓和, 鳴海哲夫, 野村渉, 橋木知恵, 駒野淳, 宮内浩典,
  • Industrial Property Rights Holder: 玉村啓和, 鳴海哲夫, 野村渉, 橋木知恵, 駒野淳, 宮内浩典,
  • Industrial Property Number: W02012/137479, PCT/JP2012/002312
  • Filing Date: 2012-04-03
  • Overseas