2013 Fiscal Year Annual Research Report
薬剤候補化合物の探索を強力に支援する幹細胞三次元共培養細胞チップの創製
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24350037
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉本 敬太郎 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (60392172)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 秀治 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任准教授 (90447318)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | バイオセンサー / 細胞チップ |
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| Research Abstract |
マイクロパタン培養法で構築された100 µm 径を有する均一な大きさのADSCスフェロイドの脂肪細胞への分化能の評価を行った。その結果、脂肪細胞関連遺伝子の発現量は単層培養よりも減少するものの、脂肪細胞への分化は単層培養と同程度で進行するもしくは不利であることが明らかとなった。これは、ADSCを不均一な大きさで三次元培養した先行研究で報告されている「脂肪細胞への分化へ明確な影響は与えない」という報告と似た結果となった。
間葉系幹細胞の二次元培養系において、密度が高くて細胞の大きさが小さい場合は脂肪細胞に、密度が低くて細胞の大きさが大きい場合に骨芽細胞に分化しやすいという報告があるが、一般的にスフェロイド培養された細胞１つの大きさは単層培養された細胞よりも小さくて細胞密度が高いことを考慮すると、スフェロイド培養されたADSCは脂肪細胞への分化が促進される可能性が高い。しかし、本研究で得られた結果から、スフェロイド培養系ではADSCの脂肪細胞分化を促進するような現象は観測されず、逆に本研究で得られた初年度の結果と合わせて考えると、骨芽細胞への分化が促進される環境であるといえる。
このように二次元培養系の先行研究結果との間に差異が生じるのは、細胞密度・細胞の大きさの他に強く脂肪細胞分化に影響を及ぼす要因があるためだと考えられる。例えば、三次元培養環境では発現している細胞間基質の種類や量が単層培養とは異なることが予想されるため、単層培養と三次元培養で発現している細胞間基質について調査を行うことで、スフェロイド培養系の分化メカニズムが解明される可能性がある。事実、骨芽細胞分化には細胞間基質のNカドヘリンとカドヘリン11が影響しているという報告がある 。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、マイクロパタン培養で提供される三次元培養環境がADSCの分化に与える影響を調査した。初年度得られた実験結果より、マイクロパタン培養系における ADSC の骨芽細胞への分化挙動に関して得られた知見として、①100 µm 系の円形マイクロパタン表面に播種後 24 時間以内に均一な大きさをもつ ADSC のスフェロイドが形成すること、②単層培養と比較して ADSC スフェロイドは骨芽細胞への分化時間が大幅に短縮できること、③ADSCの幹細胞性関連遺伝子の発現量が単層培養よりも向上することを見出した。しかし、本結果は、他の研究グループにより報告されている単層培養系で見出された結論と相反する部分がある。それは、ADSCの密度が高いときには脂肪細胞に分化しやすく、密度が低いときには骨芽細胞分化しやすいという単層培養系における報告である。細胞密度が高くなる本ADSCスフェロイド培養系において骨芽細胞への分化が単層培養時よりも促進されている点は非常に興味深い。そこで、Real Time PCR を用いる遺伝子発現量解析と Oil Red 染色を用いる脂肪細胞への分化評価を行うことでスフェロイド ADSC の脂肪細胞分化能を評価し、本三次元培養環境が中胚葉系細胞である骨芽細胞と脂肪細胞のどちらの分化に有利に働くのかを明らかとすることを目的とした。上述したように、本年度の目標である脂肪細胞と骨が細胞への分化誘導系の比較を行い、ある程度の知見が得られたが、一部未解明な部分も残った。
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| Strategy for Future Research Activity |
本スフェロイド培養系は、ADSCに骨芽細胞分化を促進する環境を提供し、脂肪細胞分化には単層培養と同程度、または不利な環境を提供していることが示された。今後は、PPARγとRunx2、骨芽細胞分化と関連することが報告されている細胞間基質のカドヘリンやフィブロネクチンのウェスタンブロットによるタンパク量の比較、BMSCとの誘導因子応答の比較などを行うことで、本三次元培養環境で培養されたADSCの分化メカニズムが解明されるかもしれない。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
臨時に入った予想外の学内の予算や京都大学との共同研究の予算で、一部使用がオーバーラップする細胞培養関連の消耗品にかかる費用が削減できたため。
マイクロプレートアッセイを自動化し、実験系の効率化を目的とするためのディスペンサーを購入。さらに、マイクロパタン以外のスフェロイド作製を検討するため、パイボーラー電源を購入する。さらに、顕微鏡周辺の高額な消耗品・物品（ミラーセットや対物レンズ、インキュベータ）などの購入を予定。
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