2013 Fiscal Year Annual Research Report
次世代天然化合物導出を指向した新規生合成ロジックの構築
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24380052
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高橋 俊二 独立行政法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, ユニットリーダー (30311608)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥村 英夫 公益財団法人高輝度光科学研究センター, 利用研究促進部門, 研究員 (90377903)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 生合成 / スピロアセタール / アルキルマロニルCoA / リベロマイシン / 放線菌 / ポリケチド |
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| Research Abstract |
I. スピロアセタール形成機構の解明：スピロアセタール環形成に関わる酵素であるRevG、RevJの結晶化条件の検討を進めたが、現在まで良好な結晶を得ることに成功していない。X線構造解析は、基質認識に関わる構造基盤の解明に重要であることから、今後も研究を推進する必要がある。
II. 新規エステル化酵素反応の解明：RevK、RevLの多量体形成について知見を得るために、Superdex200を用いたゲル濾過を検討した。精製タンパク質の混合条件によってrevK/Lの結合状態に差が認められ、相互作用の条件を見出すには更なる検討が必要と判断した。また、RevL酵素活性の検討を行ったところ、高活性化にはHis-tagの除去が必須であることを見出し、最適化条件でMESGを用いたRevLの基質特異性検討を行った。
III. アルキルマロニルCoA生合成機構の解明：還元カルボキシル化酵素(RevT)の基質となりうる炭素鎖長の異なるt-Δ2エノイルCoAの供給メカニズムを検証した。AMP結合モチーフを有するRevSを精製し、様々な脂肪酸基質との反応を解析したところ、様々な遊離の中鎖脂肪酸をアシルCoA体に変換できることを見出した。また、脂肪酸β酸化経路によりアルキル側鎖長の異なるt-Δ2エノイルCoAを生成しRevTの基質として利用されるという仮説を検証するために、13C標識された脂肪酸の取り込みを行った後にRM類を精製し、13C-NMRにより標識位置を解析した。さらに、重水素標識された脂肪酸の取り込み実験を行い、RM代謝産物をLC-MS解析することで、上記経路を検証することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
I. スピロアセタール形成機構の解明では、結晶化に成功していないが、II. 新規エステル化酵素反応の解明およびIII. アルキルマロニルCoA生合成機構の解明の研究は計画通り進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
I. スピロアセタール形成機構の解明：RevG、RevJタンパク質について、昨年度の実験データを基盤として引き続き結晶化実験を行う。精製度の向上や異なる結晶化条件の検討を行う。
II. 新規エステル化酵素反応の解明：RevL/RevKに加えてRevMの反応機構解析を行う。それぞれ結晶化の検討もおこなう。
III. アルキルマロニルCoA生合成機構の解明：昨年度の成果をさらに発展させるために、RevS、RevTに加えてRevRの機能解析を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度の研究の進展状況を考慮し、効率的に研究成果を挙げるためには、平成26年度に研究を集約させることが重要と判断した。
25年度の基礎研究に基づき、結晶化研究をさらに加速させるために、蛋白質精製システムを改良する。また、新たな結晶化の検討に向けて予算を使用する。
また、26年度は最終年度であり、多くの研究成果発表が見込まれるため、国際学会、国内学会の旅費、論文発表に使用する。
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Research Products
(22 results)
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[Journal Article] RK-1355A and B, Novel Quinomycin Derivatives Isolated from a Microbial Metabolites Fraction Library Based on NPPlot Screening.2014
Author(s)
Lim C. L., Nogawa T., Uramoto M., Okano A., Hongo Y., Nakamura T., Koshino H., Takahashi S., Ibrahim D., and Osada H.
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Journal Title
J. Antibiot.
Volume: 67
Pages: 323-329
DOI
Peer Reviewed
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