2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24380054
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三上 文三 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40135611)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | タンパク質工学 / 酵素工学 / タンパク質結晶構造解析 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の機能の多くは分子中の可動ループの構造変化によって発現されるが、その構造変化を捉えることは困難な場合が多い。可動ループが結晶中で自由に動ける結晶を調製してX線結晶構造解析を行うのが有力な方法である。本研究では実際に食品産業において用いられているβ‐アミラーゼ、アルギン酸リアーゼ、プロテイングルタミナーゼおよびトランスグルタミナーゼを取り上げ、これらの酵素の可動ループの構造と機能を徹底的に解明することを目的とした。
１．β‐アミラーゼの可動ループの解析 β-アミラーゼの活性部位に存在する二つの可動ループ上の変異体を作成し、基質アナログであるマルトースの濃度変化に対応する各ループの構造変化を捉えることに成功している。その詳細を明らかにするために野生型、T342S、 T342A、V99A、V99I等の変異体の結晶化をい、1.3 Å以上の分解能での構造解析を行った。また、ループおよび基質結合のpH変化については、凍結状態では実験の再現性が得られないため、野生型酵素の非凍結状態（キャピラリー封入）の結晶を用いて大型放射光施設で一連の予備的測定を行った。
２．トランスグルタミナーゼのプロ領域ペプチドの役割 トランスグルタミナーゼとそのプロ領域ペプチドの複合体のX線結晶構造解析を行い、複合体はプロ酵素と同様の構造をとることを明らかにした。また、このペプチドは酵素反応の阻害剤として作用することを明らかにした。
３．プロテイングルタミナーゼの活性部位の解析 プロテイングルタミナーゼのプロ体の変異体を用いて調製したSアシル中間体の構造解析から本酵素の反応機構を検討した結果、本酵素はアンモニアイオンの存在で逆反応が可能なことが推定された。そこで、触媒ポケット周辺の残基の変異により、タンパク質のグルタミン酸残基をグルタミン残基に変換する酵素の設計を行った。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Preliminary X-ray analysis of the binding domain of the soybean vacuolar sorting receptor complexed with a sorting determinant of a seed storage protein.2015
Author(s)
Maruyama, N., Goshi, T., Sugiyama, S., Niiyama, M., Adachi, H., Takano, K., Murakami, S., Inoue, T., Mori, Y., Matsumura, H., Mikami, B.
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Journal Title
Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun.
Volume: 71
Pages: 132-135
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Crystal structure of 5-formyl-3-hydroxy-2-methylpyridine 4-carboxylic acid 5-dehydrogenase, an NAD⁺-dependent dismutase from Mesorhizobium loti.2015
Author(s)
Mugo, A.N,. Kobayashi, J., Mikami, B., Yoshikane, Y., Yagi, T., Ohnishi, K.
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Journal Title
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Volume: 456
Pages: 35-40
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Structure of 4-pyridoxolactonase from Mesorhizobium loti.2014
Author(s)
Kobayashi, J., Yoshikane, Y., Yagi, T., Baba, S., Mizutani, K., Takahashi, N., Mikami, B.
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Journal Title
Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun.
Volume: 70
Pages: 424-432
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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