2013 Fiscal Year Annual Research Report
食餌性βグルカンによる腸管粘膜上皮のウイルス抵抗性増強効果と機能発現機構
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24380069
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
松田 幹 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20144131)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大島 健司 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (90391888)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | βグルカン / 腸上皮細胞 / マクロファージ / 腸管ウイルス / 食物繊維 |
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| Research Abstract |
昨年度の研究により、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1はβグルカン刺激により特異的受容体であるDectin-1の発現が上昇すること、また、THP-1細胞に取込まれたβグルカンは微粒子化されて再度放出されてナイーブなマクロファージ細胞を活性化することを明らかにした。そこで今年度は食餌性βグルカンの機能性発現において重要な役割を果たすβグルカン受容体分子で、マクロファージや樹状細胞で発現するDectin-1のβグルカン認識特異性について解析した。ヒトおよびマウスDectin-1の糖鎖認識ドメイン（CRD）をコードするcDNAを昆虫細胞発現ベクターに組み込みS2細胞で分泌発現させた。これらの組換えDectin-1CRDと種々のβグルカン糖鎖との反応性を調べた結果、ヒトとマウスのCRDでは反応性が異なることが明らかとなった。両者のCRDではアミノ酸配列およびN-型糖鎖結合もチーフの有無など一次構造上の差異が見られ、これらの差異が糖鎖結合特異性に寄与していることが示唆された。一方、昨年度に確立したヒトロタウイルスの培養腸上皮細胞を用いた感染、増殖のアッセイ系を用いて、各種サイトカインによる腸上皮細胞のウイルス抵抗性の増強効果を確認するために、感染細胞の培養上清中に放出されたウイルス粒子を特異抗体を用いたドットブロット法により定量的に解析した。その結果、培養細胞の状態およびウイルスを細胞に感染させる際のトリプシン処理条件など、複数の因子によりウイルスの感染増殖速度に差異が生じることが明らかとなり、ウイルス感染の定量的な解析のための今後の検討課題となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
腸上皮細胞へのロタウイルスの感染モデルを用いてβグルカン貪食マクロファージ由来のサイトカインによる感染抵抗性増強作用を評価するには、感染・増殖したウイルスを定量的に解析する必要がある。ドットブロット法によりウイルス粒子を半定量的に測定した結果、実験条件の微妙な差異により増殖程度が異なることは判明し、このような内因性の変動が小さいアッセイ条件の検討に時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までは、感染・増殖して培地中に放出されたウイルス粒子を抗-KU抗体を用いたドットブロット法により半定量してウイルス増殖速度を比較解析し、定量的解析が可能なことを確認したが、より早い感染初期において細胞内のウイルス検出可能な蛍光抗体細胞染色法により検出し、蛍光強度が定量可能な蛍光マルチプレートリーダーを用いて定量的に解析する手法を確立する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
ドットブロット法によりウイルス粒子を半定量的に測定した結果、実験条件の微妙な差異により増殖程度が異なることは判明し、このような内因性の変動が小さいアッセイ条件の検討に時間を要したため、研究全体が遅れているため細胞培養試薬、分析用試薬などの消耗品費の多くが次年度使用となった。
今年度は最終年度でもあり、種々の条件設定もほぼ完了しつつあるため、前年度から遅れて持ち越している実験を含めて当初の計画を実施して、全額を使用する予定である。
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[Journal Article] Norovirus binding to intestinal epithelial cells is independent of histo-blood group antigens.2013
Author(s)
Murakami K, Kurihara C, Oka T, Shimoike T, Fujii Y, Takai-Todaka R, Park Y, Wakita T, Matsuda T, Hokari R, Miura S, Katayama K.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 12;8(7)
Pages: e66534
DOI
Peer Reviewed
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