オプトジェネティクス技術を活用したヤギ卵胞発育制御メカニズムの解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24380154
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 二子 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (10608855)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 応用動物 / 神経科学 / 獣医学 / 畜産学 / GnRH / ヤギ / キスペプチン / ニューロキニンB

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、家畜の卵胞発育を制御する視床下部神経機構において、神経ペプチドのひとつであるニューロキニンB（NKB）が黄体形成ホルモン分泌頻度を亢進し、卵胞発育を刺激するメカニズムについてヤギを用いて解明することを目的とする。
平成27年度は、NKB遺伝子（TAC3）プロモーター下流にCreリコンビナーゼ遺伝子（Cre）を組み込んだアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと、光感受性イオンチャネルを組み込んだAAVベクターを同時にヤギ視床下部弓状核に注入し、Cre-loxPシステムにより視床下部弓状核の「KNDyニューロン」特異的に光感受性イオンチャネルを発現するヤギの作出を試みた。2種類のAAVベクターを設計するとともに、ヤギ視床下部弓状核への微量投与技術を確立した。
また、「KNDyニューロン」特異的に光感受性イオンチャネルを発現する遺伝子改変ヤギ作出のため、ゲノム編集技術であるTALENを用いて、キスペプチン遺伝子（KISS1）にCreを組み込んだKISS1-Creノックインヤギの作出を進めた。まず、ヤギKISS1の終止コドン近傍を切断するTALEN発現ベクターを設計し、それらをヤギ胎子繊維芽細胞へ導入してゲノムに導入された変異を検出した。その結果、設計したTALEN発現ベクターによりヤギKISS1遺伝子座に欠損が生じており、変異が導入できることが確認できた。次に、ヤギKISS1遺伝子座にCreをノックインするためのターゲティングベクターと、上記のTALEN発現ベクターを同時にヤギ胎子線維芽細胞へ導入した。その結果、ヤギKISS1遺伝子座へCreがノックインされたことを示唆する結果を得た。現在、Creリコンビナーゼノックイン細胞の単離を進めている。これらと並行して、ヤギ体細胞核移植技術の確立を行った。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Causes of Carryover

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The luteinising hormone surge-generating system is functional in male goats as in females: involvement of kisspeptin neurones in the medial preoptic area. (2015)
  • Author(s): Matsuda, F., Nakatsukasa, K., Suetomi, Y., Naniwa, Y., Ito, D., Inoue, N., Wakabayashi, Y., Okamura, H., Maeda, K.-I., Uenoyama, Y., Tsukamura, H. and Ohkura, S.
  • Journal Title: Journal of Neuroendocrinology Volume: 27 Pages: 57-65
  • DOI: 10.1111/jne.12235
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Effects of intravenous administration of neurokinin receptor subtype-selective agonists on gonadotropin-releasing hormone pulse generator activity and luteinizing hormone secretion in goats. (2015)
  • Author(s): Yamamura, T., Wakabayashi, Y., Ohkura, S. Navarro, V.M. and Okamura, H.
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 61 Pages: 20-29
  • DOI: 10.1262/jrd.2014-109
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure-activity relationship study on senktide for development of novel potent neurokinin-3 receptor selective agonists. (2015)
  • Author(s): Misu, R., Yamamoto, K., Yamada, A., Noguchi, T., Ohno, H., Matsuda, F., Ohkura, S., Oishi, S. and Fujii, N.
  • Journal Title: Medicinal Chemistry Communications Volume: 6 Pages: 469-476
  • DOI: 10.1039/c4md00514g
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differential changes in luteinizing hormone secretion after administration of the investigational metastin/kisspeptin analog TAK-683 in goats. (2015)
  • Author(s): Endo, N., Tamesaki, C., Ohkura, S., Wakabayashi, Y., Matsui, H., Tanaka, A., Watanabe, T., Okamura, H. and Tanaka, T.
  • Journal Title: Animal Reproduction Science Volume: 159 Pages: 87-93
  • DOI: 10.1016/j.anireprosci.2015.05.016
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ウシGnRHニューロン不死化細胞株の樹立 (2016)
  • Author(s): 尾崎理穂・末富祐太・松山秀一・木村康二・大蔵 聡・松田二子
  • Organizer: 日本畜産学会第121回大会
  • Place of Presentation: 東京都武蔵野市
  • Year and Date: 2016-03-27 – 2016-03-29
• [Presentation] Electrophysiological technique for monitoring the hypothalamic mechanism regulating pulsatile GnRH release in goats. (2015)
  • Author(s): Ohkura, S., Matsuda, F., Wakabayashi, Y., Yamamura, T. and Okamura, H.
  • Organizer: International Conference on Biology and Pathology of Reproduction in Domestic Animals
  • Place of Presentation: Gdansk, Poland
  • Year and Date: 2015-09-28 – 2015-09-30
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular cloning and identification of the transcriptional regulatory domain of the goat neurokinin B gene TAC3. (2015)
  • Author(s): Suetomi, Y., Matsuda, F., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K.-I. and Ohkura, S.
  • Organizer: International Conference on Biology and Pathology of Reproduction in Domestic Animals
  • Place of Presentation: Gdansk, Poland
  • Year and Date: 2015-09-28 – 2015-09-30
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いたヤギ視床下部神経細胞への遺伝子導入法の検討 (2015)
  • Author(s): 末富祐太・奥田雄大・小林憲太・大蔵 聡・松田二子
  • Organizer: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 宮崎県宮崎市
  • Year and Date: 2015-09-17 – 2015-09-20
• [Presentation] TALENを用いたシバヤギ体細胞のKISS1遺伝子改変 (2015)
  • Author(s): 舘林亮輝・佐久間哲史・山本 卓・大蔵 聡・松田二子
  • Organizer: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 宮崎県宮崎市
  • Year and Date: 2015-09-17 – 2015-09-20
• [Presentation] 弓状核へのNeurokinin B局所投与により誘起された神経活動上昇は反対側の弓状核キスペプチンニューロン群へ伝達される (2015)
  • Author(s): 若林嘉浩・山村 崇・大蔵 聡・岡村裕昭
  • Organizer: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 宮崎県宮崎市
  • Year and Date: 2015-09-17 – 2015-09-17