2013 Fiscal Year Annual Research Report
ｓｈＲＮＡ持続発現型人工ミニプラスミドによるＲＮＡｉ創薬の新展開
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24390027
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
南川 典昭 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (40209820)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 竜弘 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (50325271)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | RNAi創薬 / 非天然塩基対 / PCR / クリックケミストリー |
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| Research Abstract |
本研究課題では、short-hairpin RNA（shRNA）を持続的に発現可能な人工ミニプラスミドを創製し、これを利用したRNA干渉（RNAi）機構による遺伝子発現抑制の新しい方法論を確立する。人工ミニプラスミド創製を実現するために、１）配列の最小化のためのdSNTPを用いたPCR条件の最適化、２）人工塩基対を利用した二本鎖4’-チオDNA末端部選択的な官能基化、さらに３）導入した反応性官能基間でのクリックケミストリーを用いた環状化を検討し、これを利用したがん治療薬創製の基盤技術を確立する。
平成２５年度は、項目２）および３）を中心に検討を行った。その結果、研究代表者が開発したImNN:NaOO塩基対は、DNAポリメラーゼにより相補的な塩基として認識され、かつA:TならびにG:Gと干渉しないことが明らかとなった。この成功をうけ、PCRにおいてもこの選択性が維持されるかを検討したところ、pfx50 DNAポリメラーゼを用いた場合、最も良好な結果が得られ、そのフィデリティーは約99.5%となり第３番目の塩基対として機能することを明らかにできた。また項目３）については、化学合成した短鎖2本鎖DNAに対し、アジド化スチルベン型リンカーを介した両末端部での結合形成反応を検討した。その結果、フレキシブルなアルキルリンカーを介した場合に、両末端部での結合形成が起こるを明らかに出来た。
現在、この二つの研究成果を融合させることで、PCRで増幅させた２本鎖DNAの両末端の結合形成を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、PCRに適応可能な人工塩基対の開発と、さらに二本鎖DNA両末端の反応性官能基間でのクリックケミストリーを用いた環状化達成ができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度、次年度に研究目標はほぼ達成できた。そこで最終年度は、その成果を融合させ、人工ミニプラスミドの両末端を結合させ、環状化させる手法を確立させるとともに、それを用いた遺伝子発現抑制についてのin vitroならびにin vivo評価を行い、目的とするRNAi創薬の新手法の基盤を確立する。
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[Journal Article] PCR Amplification of 4′-ThioDNA Using 2′-Deoxy-4′-thionucleoside 5′-Triphosphates2013
Author(s)
Kojima, T., Furukawa, K., Maruyama, H., Inoue, N., Tarashima, N., Matsuda, A., Minakawa, N.
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Journal Title
ACS Synth. Biol.
Volume: 2
Pages: 529-536
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Synthesis of a novel 1,2-dithianenucleoside via Pummerer-like reaction, followed by Vorbruggen glycosylation between a 1,2-dithiane derivative and uracil2013
Author(s)
Miyazawa, T., Umezaki, K., Tarashima, N., Furukawa, K., Ooi, T., Minakawa, N.
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Journal Title
Chem. Commun.
Volume: 49
Pages: 7851-7853
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Gene suppression via U1 small nuclear RNA interference (U1i) machinery using oligonucleotides containing 2'-modified-4'-thionucleosides2013
Author(s)
Kikuchi, Y., Yamazaki, N., Tarashima, N., Furukawa, K., Takiguchi, Y., Itoh, K., Minakawa, N.
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Journal Title
Bioorg. Med. Chem.
Volume: 21
Pages: 5292-5296
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] In vitro optimization of 2'-OMe-4'-thioribonucleoside-modified anti-microRNA oligonucleotides and its targeting delivery to mouse liver using a liposomal nanoparticle2013
Author(s)
Takahashi, M., Yamada, N., Hatakeyama, H., Murata, M., Sato, Y., Minakawa, N., Harashima, H., Matsuda, A.
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Journal Title
NUcleic Acids Res.
Volume: 22
Pages: 10659-10667
DOI
Peer Reviewed
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