2012 Fiscal Year Annual Research Report
消化器癌のDNA修復系遺伝子解析による抗癌剤高感受性群の同定と個別化治療の展開
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24390321
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
掛地 吉弘 神戸大学, 医学研究科, 教授 (80284488)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北尾 洋之 九州大学, 医学研究院, 准教授 (30368617)
徳永 えり子 九州大学, 大学病院, 学術研究員 (50325453)
沖 英次 九州大学, 医学研究院, 助教 (70380392)
森田 勝 九州大学, 大学病院, 講師 (30294937)
前原 喜彦 九州大学, 医学研究院, 教授 (80165662)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 胃十二指腸外科学 |
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| Research Abstract |
1.5-FU感受性を規定するDNA修復系関連遺伝子の同定
5-FUに対する新規感受性規定因子を同定するため、ニワトリB細胞株DT40遺伝子破壊株を用いた網羅的な感受性試験を行い、重症貧血や悪性腫瘍を多発してゲノム不安定性症候群に分類される小児遺伝性疾患のファンコニ貧血の原因遺伝子群が5-FU感受性規定因子であることを見出した。5-FUによりファンコニ貧血経路活性化の指標であるFancD2のモノユビキチン化、核内フォーカス形成が誘導されることから、5-FUによるDNA損傷に対する修復にファンコニ貧血経路が深く関与することが示唆された(Fujinaka et al,DNA Repair 2012)。
2.CPTによるG2/M arrestの破壊を標的とする因子の探索
転写に依存したDNA損傷応答で、Ataxia-telangiectasia mutated(ATM)を機能不全させることで、転写による損傷が、DNA複製を介した致死的なDNA鎖切断に変換され、細胞死が増加することを見いだしてきた。CPTによるTbpI-ccを介したDNA損傷の代謝経路は複数存在するが、転写の経路からDNA複製の経路への変換は、最近注目されている合成致死モデルの1つと考えられる。CPT投与により、DNA複製を介したDNA鎖切断に応答して起こるCtIPおよびATR依存的なFancJリン酸化が見いだされた(Sakasai et al,Genes Cells 2012)。
3.CPTとproteasome阻害剤/血管新生阻害剤の併用効果の検証
胃癌細胞株MKN28,MKN45,MKN74,SNU1,kato3を低酸素(1%02)下で培養することでDNA修復遺伝子のmRNA量が減少し、線維芽細胞株MRC5では低酸素条件下でDNA修復遺伝子のmRNA量が増加した(データ未発表)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、消化器癌、特に胃・大腸癌において標準治療で用いられる5-fluorouracil(5-FL), Irinotecan(CPT), Platinum(CDDP,L-OHP), Taxanes(Docetaxel, Paclitaxel)の各々の薬剤について作用点を探索して感受性を規定している分子を同定し、治療効果のpredictive markerの確立と感受性規定因子を標的とした治療法の開発を目指すことである。現在までに、1.5-FU感受性を規定するDNA修復系関連遺伝子としてファンコニ貧血経路活性化の指標であるFancD2,に注目し、機能解析を行っている。2.CPTによるG2/Marrestの破壊を標的とする因子を探索し、CPT投与により、DNA複製を介したDNA鎖切断に応答して起こるCtIPおよびATR依存的なFancJリン酸化が認められた。3.CPTとproteasome阻害剤1血管新生阻害剤の併用効果の検証については、胃癌細胞株を低酸素(1%O2)下で培養することでDNA修復遺伝子のmRNA量が減少し、線維芽細胞株MRC5では低酸素条件下でDNA修復遺伝子のmRNA量が増加することがわかってきた。同様の検討を大腸癌細胞株でも検討し、胃癌および大腸癌の低酸素感受性、抵抗性の株を選択し、まずCPTと血管新生阻害剤との併用で治療を行い、無治療群と比較検討を行う準備をしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.5-FU感受性を規定するDNA修復系関連遺伝子の同定:(1)細胞株を用いたin vitroでの解析;1)DNAミスマッチ修復などのDNA修復に関与する因子について現在進行中の解析を進めて網羅的に遺伝子破壊DT40株を用いたcolony survival assayにて5-FUの細胞毒性の遺伝的要求性を解析する。2)1)の結果をもとに大腸癌細胞株を5-FUで刺激し、特定の遺伝子蛋白についてリン酸化やモノユビキチン化をWestern blottingで検証する。さらにプラスミドやウイルスを用いた過剰発現系やsiRNA法により同定された遺伝子発現を変化させ、5-FU感受性に与える影響を細胞増殖能などで検証し、5-FU感受性を亢進する方法を探索する。(2)臨床切除標本を用いたin vivoでの検討:大腸癌の手術症例を用いて、細胞株で高度な耐性あるいは感受性を示した遺伝子蛋白の発現を抗体による免疫組織化学染色で評価し、抗がん剤感受性やマイクロサテライト不安定性などとの相関を調べる。
2.CPTによるG2/Marrestの破壊を標的とする因子の探索:(2)CPTによるG2/Marrestの破壊を標的とした因子の探索CPTによるTopI-ccの代謝経路に注目し、合成致死を引き起こしうる標的分子を探索する。
3.CPTとproteasome阻害剤1血管新生阻害剤の併用効果の検証:胃癌および大腸癌の低酸素感受性、抵抗性の株を選択し、まずCPTと血管新生阻害剤との併用で治療を行い、無治療群と以下の比較検討を行う。(1)carと血管新生抑制剤bevacizumab併用による抗腫瘍効果の解明と(2)大腸癌切除標本を用いたbevacizumab併用による抗腫瘍効果の解明:いずれも低酸素と血管新生をHIF-1,pimonidazole,CD31に対する免疫組織化学染色でHIF-1蛋白発現、壊死部分面積、血管数、血管床面積で評価する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究では、動物実験を行うため、動物購入費が必須である。ヌードマウスの購入・飼育に必要な費用と、さらに本研究ではsiRNA導入による腫瘍治療実験も行うため、それに見合った動物購入費を設定した。また、生化学的試薬・培養用試薬・実験機材に関しては市場価格と照らし合わせて算定した。その他に本研究の研究成果発表、論文投稿のための経費を算定した。
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