2013 Fiscal Year Annual Research Report
エナメル質成熟化の新パラダイム：エンドサイトーシスに拠らない蛋白脱却機構の証明
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24390408
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
高野 吉郎 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90126425)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田畑 純 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (20243248)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | enamel matrix / amelogenin / proteasome / ubiquitin / エナメル質 |
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| Research Abstract |
平成２５年度は、ヒト歯胚におけるエナメル蛋白質のサイトゾル内処理機構の検証と、ラット歯胚の器官培養系を用いたOATの機能解析を中心に研究を遂行した。
1. ヒト歯胚における有機アニオン輸送体の局在とエナメルタンパク質の処理機構：海外共同サイトゾル内蛋白分解関連分子の局在を免疫組織化学的に検討した。基質形成開始期のエナメル芽細胞は、遠位端の細胞膜にOAT2の免疫活性を認めた。OAT3はトームス突研究者より供与されたヒト歯胚のパラフィン包埋試料を用い、OAT1, 2, 3, アメロゲニン、起と細胞内小胞構造が陽性で中間層は陰性であった。形成期エナメル芽細胞は細胞内が一様にアメロゲニン陽性で、プロテアゾームも陽性であったことから、基質形成初期のエナメル器では、OAT3を除く関連分子の局在はヒト歯胚とラット歯胚でほぼ同様であることが示された。
2. 免疫反応の検出感度と再現性の検証： 本研究は免疫組織化学を主たる研究手法とするため、染色感度と免疫局在の再現性の確認は極めて重要である。エナメル芽細胞のサイトゾルに見られた拡散性の反応は抗原の賦活化処理をしないと殆ど検出できない。異なる個体から作成した複数のサンプルで同様な結果が得られ、データの再現性、信頼性が再確認された。
3. ラット歯胚器官培養系へのOAT阻害剤の影響： ラット臼歯歯胚の器官培養系に高濃度のOAT阻害剤probenecid(10mM, 20mM)を添加し、非添加群とともに高酸素分圧(95% O2, 5%CO2)下で短期培養して、エナメル芽細胞のアメロゲニン免疫反応を検討した。OAT阻害剤添加群は細胞形態が良く維持され、ゴルジ装置に強いアメロゲニン免疫反応が認められたが、サイトゾルに反応はなかった。非添加群との差の検証はサンプル数を増やす必要があり、研究最終年度に引き続いて本研究を行うこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
立案した４つの課題のうち、以下の２つの課題はおおむね予定通り遂行できた。
課題２．「歯胚の器官培養系へのOAT阻害剤とユビキチン・プロテアゾーム阻害剤投与の影響の検討」は器官培養条件を定めて実験群と対照群の形態およびアメロゲニン免疫染色結果を比較検討した。結論は未だであるが、最終年度に継続実施し個体数を増やして有意差の有無を明らかにする。
課題３．「ヒト歯胚における有機アニオン輸送体の局在とエナメルタンパク質のサイトゾル内処理機構の検討」は海外研究協力者から試料の提供を受け、計画通り完了した。
課題１のエナメル質基質断片の免疫電顕による局在の検討は、研究最終年度の課題とした。課題４のOATノックアウトマウスの表現形解析は、同マウスの入手が不可能となったため、断念した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は本研究計画の最終年度にあたり、今年度までにデータ取得が完了しなかった２つの研究課題について実験を継続実施して完了するとともに、既に完了した実験についてもデータの再現実験を行う。
また、過去2年に渡って実施した本研究の結果から、その存在が明らかとなったエナメル芽細胞のサイトゾルにおけるアメロゲニンの免疫反応が、エナメル芽細胞の蛋白合成分泌系における品質管理に関わる現象である可能性も想定し、新たな視点からデータの再検討を試みる予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
別経費で購入した試薬、実験器具等が共用可能であったため、計画当初より購入する品目の個数が少なくて済んだため。また、一部試薬等が当初予定より安く購入できたため次年度使用額が生じた。
次年度は使用可能な別経費が見込まれないため、試薬、実験器具等の購入費用に従前より多く充てる必要がある。
また次年度は研究最終年度であり、資料整理のための作業量が多く見込まれる。そのための補助者への謝金に充てる。
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[Presentation] Alveolar bone loss induced by hypofunctional tooth movement in rats.2013
Author(s)
Chisa Shitano, Otto Baba, Sawa Kaneko, Jun Hosomichi, Yasuhiro Shimizu, Naoki Shibutani, Risa Usumi-Fujita, Yoshiro Takano, Takashi Ono
Organizer
IADR-APR, JADR General Session 2013
Place of Presentation
Bangkok, Thailand
Year and Date
20130821-20130823
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