2013 Fiscal Year Research-status Report
ヘムオキシゲナーゼの触媒機構と蛋白質間相互作用ネットワークの解明
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24510301
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 寛 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安永 卓生 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (60251394)
小松 英幸 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (90253567)
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| Keywords | ヘム / ヘムオキシゲナーゼ / シトクロムP450還元酵素 / タンパク質間相互作用 / カロリメトリー / 触媒機構 |
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| Research Abstract |
１．ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）のヘム結合のカロリメトリー解析：直接および間接滴定法を用いて、HO-1野生型および変異体すべての解析を完了した。K18Aは野生型に比べ親和性と熱力学パラメータ共に変化が無かった。K179A，R183A，K179A/R183Aでは、エンタルピー減少がエントロピー増加で補償され、野生型に比べ親和性の減少はわずかであった。一方、K18A/K179A/R183Aでは大きく親和性が減少し、alpha選択性が失われていた。つまり、Lys18は野生型では結合に関与していないが、Lys179とArg183の変異をレスキューするという興味深い結果が得られた。また、酵素活性を測定したところ、K18A以外の変異体に活性の低下が見られた。
２．HO-2とシトクロムP450還元酵素（CPR）との表面プラズモン共鳴（SPR）による相互作用解析：ヘム分解産物ビリベルジン（BV）とHO-2の複合体を作製し、CPRとの相互作用解析を行ったところ、BV-HO－2複合体はCPRとの結合を示さなかった。このことから、BVによるapo型HO-2の相互作用解析への影響はなく、apo型 HO-2におけるCPR結合能がサポートされた。また、BV結合により、HO-2で微小なコンホメーション変化が起こり、CPRに結合できなくなったと考えられる。
３．HO-2のヘム調節モチーフ（HRM）とヘム結合性の検討：2つのHRMを含む配列に対応する長鎖ペプチドアナログとHRMを一つずつ含む短鎖ペプチドアナログを合成し、滴定実験によってヘムとの結合親和性を検討したところ、２つのHRMのヘム親和性は異なり、Pro残基を置換するといずれも親和性が低下することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題では、「I．基質ヘムとHOとの結合をカロリメトリー解析し、その熱力学的パラメータを求める」、「II．HOによるヘム分解反応の中間過程を明らかにする」、「III．HOを含むヘム分解系酵素間の相互作用ネットワークを明らかにする」の３つを研究目的として挙げている。このうち、Iについては、これまで蛋白質とヘムとの相互作用について熱力学的パラメーターを用いて詳細に記述した例はほとんどなく、本研究で配位結合，静電相互作用，疎水相互作用の寄与を議論できたことの意義は大きい。また、【研究業績の概要】に記載した通り、予想していなかった興味深い結果も得られた。当初予定していた実験はほぼ終了し、現在論文執筆中である。
その他の項目についても順調にすすんでおり、その成果として、計5件の研究発表を行い、１報の研究論文を発表した。特にHO-2とCPRの相互作用のSPR解析は実験を終了し、現在投稿論文執筆中である。
以上の成果に基づき自己点検を行い、本課題研究を上記のように評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も引き続き計画に従って実験を行う。
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