2015 Fiscal Year Annual Research Report
細胞で行われる核酸反応を解明するための新規モデル実験システムの構築と利用
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24550200
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
中野 修一 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (70340908)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 分子クラウディング / DNA二重鎖 / 融解温度 / リゾチーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、様々なタンパク質を用いて構築したモデル実験系を用いて、タンパク質による分子クラウディング環境がDNA二重鎖に与える影響を検討した。前年度に行った実験では、タンパク質の溶解度に限界があることから、5%を超える濃度による検討を行うことはできなかった。そこで、高濃度のクラウディング環境をつくり出すために、タンパク質とポリエチレングリコール（PEG）を共存させた「ハイブリッド型実験系」の構築を試みた。PEGが共存することによってタンパク質の溶解度は低下したが、PEGとタンパク質を合わせて20%のクラウディング溶液を調製することができた（うちタンパク質濃度は1~3%）。この実験系を用いてDNA二重鎖の融解温度（Tm）を蛍光測定によって算出したところ、本研究で用いたタンパク質（ウシ血清アルブミン、リゾチーム、ミオグロビン、ヘモグロビン、脂肪酸結合タンパク質）の中では、リゾチームだけがDNAのTmを上昇させる作用をもつことが見出された。この現象は、タンパク質による排除体積効果や溶液物性（粘度、水の活量、誘電率など）で十分に説明することができず、リゾチーム特有の性質（表面電荷など）が原因で生じた可能性がある。そこで、ループ構造を有するDNAに対して実験を行ったところ、DNA構造によってTmの上昇度が大きく異なり、熱融解曲線の形状から、PEG 存在下ではリゾチームはDNAと結合している可能性が考えられた。また、共存させるPEGの分子量が大きくなるほどTmの上昇度が大きくなり、タンパク質による分子クラウディング環境がDNAの構造安定性に大きな影響を与えうることが示された。このハイブリッド型実験系によって、分子クラウディング環境ではDNAとタンパク質の弱い相互作用が顕著になることが明らかになり、これは細胞の分子クラウディング環境が核酸に与える影響を解明する上でとても重要な知見である。
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