2012 Fiscal Year Research-status Report
ＧＡＬＰ産生ニューロンの求心路の遺伝子工学的同定とその機能形態学的解析
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24590241
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kiryu University |
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Principal Investigator |
影山 晴秋 桐生大学, 医療保健学部, 准教授 (00433839)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塩田 清二 昭和大学, 医学部, 教授 (80102375)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ニューロンネットワーク / 摂食調節 / 求心性ニューロン / Cre-loxPシステム / 免疫染色 |
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| Research Abstract |
ガラニン様ペプチド（GALP）は摂食調節とエネルギー代謝に深く関わっているペプチドである。これまでに我々は摂食調節にかかわるニューロンネットワークをラットで解析し、報告してきた。しかしながら、GALP mRNAの発現やペプチド含量は非常に低く、免疫染色法によるニューロンネットワークの解明は極めて難しい。そこで、我々はGALPニューロンを形態学的に解析するためにCre-loxPシステムによってGALP発現細胞特異的に逆行性輸送機能を付加した緑色蛍光タンパク質（GFP）とβ-ガラクトシダーゼを共発現するトランスジェニック（Tg）マウスを作出した。このTgマウスにタモキシフェンを連続7日間投与した後、灌流固定し、凍結切片あるいはビブラトーム切片を作製した。抗GFP抗体による蛍光免疫染色あるいは酵素抗体法を用いた免疫染色を行い観察した。さらに酵素抗体法とβガラクトシダーゼアッセイの二重染色を行った。GALP産生細胞を示すβガラクトシダーゼアッセイの結果より、GALP産生細胞は僧帽細胞層、蓋ひも、梨状葉、室傍核、弓状核、海馬、青斑核、小脳に分布していた。さらにGFPのみが免疫陽性、すなわち、起始部位は視床背側前核、内側手綱核、中隔、内側視索前野であることを観察した。以上の結果より、これまでラットでは弓状核に限局して存在しているといわれたGALP産生ニューロンはマウスにおいては弓状核以外にもいろいろな神経核に分布していることを明らかにした。僧帽細胞層や蓋ひも、梨状葉は嗅覚路を構築する神経回路網であり、また海馬は学習・記憶や嗅覚路にも関与していることから、GALPは摂食やエネルギー代謝だけでなく、嗅覚や学習・記憶にも関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究ではマウスにおけるGALP産生細胞の分布・局在を同定し、さらにGALP陽性細胞を調節している求心性ニューロンの同定を行った。
GALP産生ニューロンが多く集まっている神経核および求心性ニューロンの起始部位が同定できたので、当初の計画通りに実験が進んでいるものと思われる。しかし求心性ニューロンの起始部位の神経核までは同定できたものの、当初予定していた3重蛍光免疫染色によってこのニューロンの性質を同定するところまでは年度内に完遂できなかった。今年度はCre-loxPの系がこの遺伝子改変マウスで作動することが確認でき、さらにはマウスにおけるGALPの局在も明らかにしたので、当該研究の目標をほぼ達成したと自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度では同定できなかった求心性ニューロンの同定を行う。またニオイや摂食ペプチドを投与するなど外部刺激を行い、外部刺激による神経の活性化をcFos抗体を用いて、評価する予定である。どの外部刺激がGALPニューロンを興奮させることができるのかと言うことを検討することによって、実際のGALP産生ニューロンを興奮させる経路が、トレーサーを使った機能形態学的実験以外からも明らかにすることができると考えている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当該年度で行う予定だった求心性ニューロンの性質を同定する実験があまり進まなかった。これは求心性ニューロンの同定に時間がかかり、結果がでたときは3月中旬であったことから、その実験まで到達できなかったからである。したがってニューロンの性質を同定するために使用する抗体の購入を次年度に見送った。次年度は求心性ニューロンの性質を同定することを計画している。また申請時に米国神経科学会の旅費を計上していたが、大学の講義の日程とうまく調整できなかったので、参加することができなかった。以上の理由で当該助成金が発生してしまった。
旅費として計上したものを、申請時の計画では購入する予定になかったが、最近になって新しいペプチドが見つかったので、その購入代にあて、次年度の実験に使用する予定である。
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