2012 Fiscal Year Research-status Report
日本人悪性中皮腫に高頻度で見出された３ｐ領域欠損の機能解析と診断への応用
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24590715
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Hyogo Medical University |
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Principal Investigator |
玉置 知子(橋本知子) 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (10172868)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉川 良恵 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (10566673)
森永 伴法 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (10351818)
久保 秀司 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (10441320)
中野 孝司 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (10155781)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 悪性中皮腫 / BAP1遺伝子 / 3p21 / PBRM1遺伝子 / MLPA法 |
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| Research Abstract |
日本人悪性中皮腫において高頻度に見いだされた3p21領域の欠損部位に含まれる遺伝子、BAP1の変異状況の確認、および、3p21のBAP1近傍遺伝子欠損と併せて細胞機能への影響を解析した。
悪性中皮腫におけるBAP１遺伝子変異については、欧米では塩基置換による変異が報告されるが、我々の本邦症例の解析では１アレルもしくは両アレル欠損が多く見いだされ、しかも欠損を含めた全体のBAP１変異頻度は欧米よりも数倍高い。定量的PCRで欠損をゲノムレベルで検出するためには高度な技術が必要となり迅速診断には向かないため、ゲノム量を定量的に知ることができるMLPA法での検出が可能かどうかを試みた。その結果、MLPAではBAP1各エクソンについての定量的な解析が可能であることが示された。現在、MLPA診断精度の検討を行っている。
悪性中皮腫では、3p21領域近傍のPBRM1の欠損が見られる症例があることも我々は報告してきた。PBRM1欠損の頻度は、BAP1欠損の頻度よりも低いが、塩基置換例を見出すことができたため、欠損症例にとどまらずPBRM1機能欠損を伴う例がさらに見いだされる可能性がある。
これら2つの遺伝子の機能欠損の影響を見るため、正常中皮由来の細胞株にsiRNAを導入する発現抑制実験を行った。BAP1のsiRNA導入では、予想に反して細胞のapoptosisが引き起こされた。PBRM1のsiRNA導入では、細胞増殖には顕著な影響は見られなかった。しかし、短時間の低濃度処理では、いずれのsiRNA処理でも、DNA修復の遅延傾向が認められた。
一方で、悪性中皮腫患者さんの正常細胞（生殖細胞系列）では、BAP1変異がないことは我々はすでに発表しているが、PBRM1についても生殖細胞系列変異は見いだされなかった。正常対象群の正常ゲノム多型との比較については、現在解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１． BAP1遺伝子欠損をMLPAで検出することが可能となった。（評価）MLPA法は、迅速なスクリーニング検査として優れている。日本の悪性中皮腫では上皮型が頻度が高くかつ治療への感受性が他の組織型に比べて高い。BAP1遺伝子変異は、この上皮型の80%以上に認められることから、MLPA法の有効性を-シークエンシング法等で検証することで、悪性中皮腫のタイプ診断や早期診断を迅速に実施できる技術となる。よって引き続き解析を続ける必要がある。
２．BAP1近傍の遺伝子変異を検索し、少数例ではあるが塩基置換例を見出した。（評価）PBRM1遺伝子に欠損以外に塩基置換による遺伝子機能欠損がある症例があることが判明した。この遺伝子は腎がんでの欠損も明らかになってきており、今後、悪性中皮腫の発症機構との共通点を明らかにできる可能性がある。またBAP１単独欠損と両方の欠損で臨床症状の違いがあるかどうか、など、臨床面でも評価が必要である。
３．正常中皮細胞株で、BAP1もしくはPBRM1の発現抑制実験をおこなった。（評価）BAP1遺伝子発現抑制により、予想に反してアポトーシスが誘導された。さらに検討が必要である。PBRM1ではそのような影響は見られなかった。２つの遺伝子のそれぞれの発現抑制により、DNA障害の修復に影響がみられたことから、これらの遺伝子のノックダウンはゲノムの不安定性に寄与する可能性が示された。
４．悪性中皮腫患者さんの生殖細胞系列のゲノムを検索した。（評価）悪性中皮腫患者さんの生殖細胞系列（正常細胞）では、3p21の上記２つの遺伝子の欠損等は検出できなかった。患者さんと正常対象群の生殖細胞系列多型の比較解析については、現在患者さんの多型データが出つつあり、検討を続ける必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．BAP1遺伝子欠損・変異のMLPA法とあわせて、悪性中皮腫の全例で欠損している9p21領域のCDKN２A遺伝子をターゲットとするMLPA法を確立し、悪性中皮腫の迅速診断、および上皮型の迅速診断に発展させる。
２．BAP1、PBRM1の中皮細胞および悪性中皮腫細胞における細胞生物学的な役割を明らかにする。発現抑制、および発現誘導をおこなって評価する。
３．悪性中皮腫患者さんの正常ゲノムと正常コントロール群の正常ゲノムを比較する。悪性中皮腫の「なりやすさ」の指標があるかどうかを検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品：分子遺伝学的解析に関わる試薬、培養機材が必要である
コンピューター：24年度にはコンピューターを導入せずに遺伝子解析が可能であったが、本年度にデータ量が多く蓄積され、現有のコンピューターでの解析が困難になる可能性があるため、購入する。
謝金：実験支援者のための人件費、および論文校閲費用を必要とする
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