2013 Fiscal Year Research-status Report
人工肝細胞移植系を用いたＨＣＶ感染動物モデルの構築
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24590959
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
東 正新 (陳 正新) 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (10376783)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柿沼 晴 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 寄附講座講師 (30372444)
渡辺 守 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10175127)
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| Keywords | 移植 / 発生・分化 / 再生医学 / 肝疾患治療 / 細胞・組織 |
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| Research Abstract |
最近マウス線維芽細胞に２種類の遺伝子を導入するのみで、人工肝細胞を樹立することが可能であると示された。我々は今回申請する研究において、マウス線維芽細胞より人工肝細胞を樹立し、その細胞移植系を利用した新規のC型肝炎ウイルス(HCV)感染モデル動物をマウスにおいて確立し、その知見を基盤に新規のHCV感染モデル動物の構築を試みる研究を行い、下記の成果を得た。
(1) マウス人工肝細胞の樹立、培養、in vitroでの形質解析：研究グループはマウス肝臓から高速セルソーターを用いて初代肝幹･前駆細胞を分離・濃縮し、分化誘導するとともにその形質を解析した。その結果、Wnt5aが門脈周囲の肝幹･前駆細胞による胆管形成を抑制的に制御し、正常に進行させるために重要な因子であることを初めて示し、胆管形成に係わる新たなメカニズムを提示した（Hepatology, 2013）。さらにマウス線維芽細胞からHNF4α及びFoxa3の強制発現によって人工肝細胞を誘導するとともにその形質を分子生物学的に解析した。
(2) マウス人工肝細胞を用いた移植モデルの開発：我々は移植した初代肝細胞・初代肝幹細胞によって、高度のドナーキメリズムが得られる細胞移植系を独自に開発した。さらに本移植系を用いて移植後のドナーキメリズムを定量的に評価・追跡できる移植系の構築に成功した。
(3) ヒトHCV receptor強制発現によるマウス人工肝細胞を用いたHCV感染モデルの構築：人工肝細胞にヒトCD81遺伝子及びヒトoccludin遺伝子の強制発現を行うことで、移植系がヒトHCV receptor強制発現人工肝細胞にも応用可能であるか検討した。
(4). ヒト人工肝細胞誘導法の検討：細胞バンクより入手したヒト線維芽細胞株に肝特異的遺伝子の強制発現によって人工肝細胞を誘導しうるか検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)マウス肝幹･前駆細胞の形質解析については、想定通りの進捗を得た。すなわち、その結果をまとめた論文が肝臓病学で最も難易度の高い国際学術雑誌：Hepatology に採択され発表することができた。本論文の結果は、Wnt5aが門脈周囲の肝幹･前駆細胞による胆管形成を抑制的に制御し、正常に進行させるために重要な因子であること、さらに肝幹･前駆細胞におけるWnt5aの
標的分子がCaMKIIである可能性をそれぞれ世界で初めて示し、胆管形成に係わる新たなメカニズムを提示したと言える。並行して、マウス線維芽細胞からHNF4α及びFoxa3の強制発現によって人工肝細胞を誘導する系では、肝細胞系譜特異的な遺伝子発現が得られたため、次の段階に進んだ。
次に(2).マウス人工肝細胞を用いた移植モデルの開発については、詳細な条件検討を行い、肝幹･前駆細胞などドナー細胞にMMP2の強制発現を行うことで移植効率が改善するところまでは解明できた。しかしながら依然として効率が低く止まるため、この結果をもとに次年度はさらに研究を進行させる予定である。
(3) ヒトHCV receptor強制発現によるマウス人工肝細胞を用いたHCV感染モデルの構築については、ヒトCD81遺伝子及びヒトoccludin遺伝子の強制発現系を構築し、感染の有無を確認するべく検討中である。(4). ヒト人工肝細胞誘導法の検討については細胞バンクより入手したヒト線維芽細胞株に肝特異的遺伝子の強制発現によって人工肝細胞を誘導しうるか検討を行い、一部の遺伝子発現を確認し得た。
いずれも順当な進行がみられるが、データとして不完全な点が残されているため次年度も継続して計画を進行させる必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
前記の(1)-(4)に関しては平成２４年度・及び平成２５年度の結果に基づき、さらにこれを継続して遂行する予定である。この中でも特に、マウス肝幹/前駆細胞の形質解析と、ヒトHCV receptor強制発現によるマウス人工肝細胞を用いたHCV感染モデルの構築については、継続して重点的に計画を進行させる予定である。
さらに次年度には下記の計画にも着手する予定である。
(5) ヒト人工肝細胞を用いた移植モデルの開発：前述の(1)-(4)によって得られた研究結果を基盤に、ヒト線維芽細胞から誘導したヒト人工肝細胞を用いたマウス肝臓置換動物モデルの構築を図る。具体的にはNOD/SCIDマウス或いはNOGマウスをレシピエントとして、前述のレトロルシン反復投与及び部分肝切除の前処理を組み合わせ、ヒト人工肝細胞による高率置換動物モデルの
構築を図る。系が確立された後には、置換率とヒトアルブミン血中濃度の相関を見ることによって、犠死させない状態で置換率を推測し、HCV感染に利用できる動物か否かを検討する。
(6). ヒト人工肝細胞移植マウスを用いたHCV感染モデルの構築：最後に、得られたiHepによる置換マウスが構築できた場合には、HCV感染が可能か否かを検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
計画金額よりも使用した金額が少なかったのは下記の理由による。
実験計画が比較的順調に経過・進行していることから、予定よりも少量の研究試薬を使用するのみで、計画の進展が見られていること、及び試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。なお、本計画では経費の70%程度が消耗品として計上していたこともから、その価格・数量が変化したことで経費執行が変化したと考える。
本年度は計画３年目に相当するため、もともと経費を少額に見積もっていた。しかし、研究計画が順調に発展した結果、検討する実験の数・種類を発展的に拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Genetic variation near interleukin 28B and the risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C.2014
Author(s)
Asahina Y, Tsuchiya K, Nishimura T, Muraoka M, Suzuki Y, Tamaki N, Yasui Y, Hosokawa T, Ueda K, Nakanishi H, Itakura J, Takahashi Y, Kurosaki M, Enomoto N, Nakagawa M, Kakinuma S, Watanabe M, Izumi N.
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Journal Title
J Gastroenterol
Volume: in press
Pages: Epub
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Comparison between Gd-EOB-DTPA MRI and CTHA/CTAP for detection of hypervascular hepatocellular carcinoma: efficacy of diffusion weighted image and hepatobiliary phase.2013
Author(s)
Azmua S, Asahina Y, Sakurai Y, Ootani S, Yamanaka H, Kawai F, Fujiki J, Kitazume A, Murakawa M, Nakagawa M, Kakinuma S, Watanabe M.
Organizer
22nd Conference of the Asian Pacific Association for the Study of the Liver.
Place of Presentation
Singapore (Singapore)
Year and Date
20130609-20130609
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