2012 Fiscal Year Research-status Report
脂質応答性転写因子の抗線維化作用の解析と新規治療薬の探索－低酸素性腎障害を中心に
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24591193
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
木村 秀樹 福井大学, 医学部附属病院, 准教授 (20283187)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩野 正之 福井大学, 医学部, 教授 (20275324)
菅谷 健 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 客員教授 (40381561)
糟野 健司 福井大学, 医学部, 准教授 (60455243)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 進行性腎障害 / 尿細管上皮細胞 / L-FABP / PPAR / 抗線維化作用 |
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| Research Abstract |
１）L-FABP発現のmProxに関する検討
mProxはC57BL/6Jﾏｳｽの近位尿細管細胞をSV40処理して作製し、同細胞株に転写領域を含んだﾋﾄL-FABPｹﾞﾉﾑ遺伝子(5360bp)を導入してFABP-mProxを作製した。FABP-mProxは、mProxに比して、ﾋﾄL-FABPのmRNA発現が約1000倍に、蛋白が約300倍に増加していた。mProxに比してFABP-mProxで、PPAR-αのmRNAが10倍に増加し、PPAR-γmRNAが1/10に減少した。FABP-mProxで、ﾊﾟﾙﾐﾁﾝ酸のPPAR-α活性は50%増加し、PGJ2のPPAR-γ活性は両細胞で同等であった。FABP-mProxで、基底状態とTNF-α刺激でのMCP-1発現が有意に低値であり、一方、低酸素誘導性のVEGF-A発現はFABP-mProxとmProxで同等であった。TNF-α刺激はFABP-mProxのL-FABP発現を増加した。これらの結果から、mProxにおけるL-FABPの高発現は、PPAR-α発現と活性を増強し、炎症性反応を抑制する一方で低酸素反応性を保持して、細胞保護に作用する可能性が見出された。
２）PPAR-α欠損マウスとL-FABP発現マウスの解析
PPAR-α欠損マウスについては、対照のS129マウスに比して、通常飼育の12、24ヶ月齢で有意に心筋線維化を認めた。通常飼育の6ヶ月齢や3ヶ月間低酸素飼育後の6ヶ月齢では、心筋線維化に有意差は認めず、全月齢で腎線維化にも有意差を認めなかった。
L-FABP発現マウスの腎組織の解析については、マウス自体の譲渡に時間が必要な状況であったため、提供された腎組織について解析した。対照B6マウス腎に比してPPAR-αのmRNAが70％増加し、PPAR-γmRNAが50％に減少し、mProxの実験結果と同様の傾向を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ﾏｳｽの近位尿細管細胞の細胞株mProxとﾋﾄL-FABP過剰発現のFABP-mProxに関する実験は、概ね予定通りに進んでおり、L-FABP発現マウスの腎組織の解析もある程度実施できた。しかしながら、変異型HIF-1α発現のmProxに関する実験が実施できなかった点、L-FABP発現マウスの当施設での飼育がまだ出来ず、平成25年度に向けての実験準備が遅れている点を考えると、予定よりやや遅れていると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
LFABP-mProxとmProxを用いた実験では、mProxに比してL-FABP-mProxでTNF-α刺激性のMCP-1発現が抑制されているため、まず、このMCP-1発現がNFkB, MAPK, Smad等のどのｼｸﾞﾅﾙ伝達経路を介しているかを特異的阻害薬を用いて解析し、さらに、どの経路シグナルがL-FABP-mProxに於いて減弱しているかを解析する。また、PPAR/FXR活性化薬でさらに抗炎症・抗線維化作用が増強する場合は、PPAR,FXR依存性を検討する。
PPAR-α欠損マウス(S129系)、L-FABP発現マウス(B6系)において腎線維化を評価する際に、UUOでは組織障害の評価が難しい場合があるため、アリストロキア酸の腹腔注入による腎間質線維化を検討する。注入後5日で線維化が誘導されるため、各マウス群で腎障害度の評価が容易と考えられる。各群の腎組織での線維化、マクロファージ浸潤、MCP-1、PAI-1、コラーゲンI等の発現を比較する。一方、FABP,PPARの発現量を検討し、腎線維化との関連性を解析する。さらに、低酸素飼育で線維化が増悪するか否か、あるいはPPAR活性化薬が線維化抑制作用を示すか否かも検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度に使用予定であった変異型HIF-1α発現のmProx（マウス近位尿細管上皮細胞株)とヒトL-FABP発現マウスについて、諸事情で受け入れが遅延したため、その部分の実験費用を使用せず、次年度に持ち越すことを余儀なくされた。次年度は同細胞と同マウスを速やかに受領し、以下１）、２）の実験計画を持ち越した研究費を用いて追加実施していく。
1) mProxと変異型HIF-1a発現mProxで、H-,L-FABP、PPAR、FXRのmRNAと蛋白発現変量を比較する。変異型HIF-1a発現mProxで、PPAR/FXR活性化薬がCTGF, ﾌｨﾌﾞﾛﾈｸﾁﾝ, ｺﾗｰｹﾞﾝI、線維芽細胞特異的蛋白(FSP)-1の発現を抑制するか否かを検討する。
2) L-FABP発現マウスと対照マウス(B6ﾏｳｽ)において、ﾏｳｽL-FABP, H-FABP, BABP, PPAR, FXRの発現をreal time PCR 法、Immunoblot法、免疫組織染色法で解析し比較する。L-FABP発現マウスで発現が増強した遺伝子が存在する場合は、その上流遺伝子発現の変化を解析する。
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