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2012 Fiscal Year Research-status Report

リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の新規病因自己抗原候補76kD蛋白の病態への関与

Research Project

Project/Area Number 24591360
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

椙村 益久  名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (50456670)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大磯 ユタカ  名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40203707)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywordsリンパ球性漏斗下垂体後葉炎モデル / ES-AVPニューロン
Research Abstract

1.リンパ球性漏斗下垂体後葉炎モデルの作成
コムギ胚芽を用いた無細胞翻訳系で、コムギ胚芽発現用ベクターとして開発されたpEU-E01-MCSにHisタグで標識したベクターを構築し、合成したリコンビナント76kD蛋白と結核菌の菌体成分を加えたcomplete Freund’s adjuvant (CFA)とを混合しエマルジョンを作成しSJL/Jマウスに投与しリコンビナント76kD蛋白免疫動物を作成した。通常1回目は後肢と反対側そけい部に皮下注射し7日後に反対側に投与する。約14日後に採血しELISA法で抗体価が上昇していることを確認した。マウスを安楽死させ採血とともに下垂体組織を摘出し、切片標本を作製した。
2.ES-AVPニューロンの分化誘導
マウスES細胞よりSFEBq/gfCDM法を用い、ES-AVP細胞を含む視床下部前駆細胞を選択的に分化誘導し、分散培養も行った。その培養系で、エレクトロポレーション法やリポソーム法を用いた遺伝子導入による76kD蛋白の過剰発現や、siRNAによるノックダウン実験に成功した。さらにES-AVP細胞でのAVP小胞に蛍光タンパク質を融合させ、time lapseイメージングでAVP小胞の可視化に成功した。また、全反射蛍光顕微鏡を用いた開口放出解析も可能になった。また、タンパク質間相互作用をPull-Down Assay、免疫沈降法で解析した。現在76kD蛋白ノックダウンのAVP分泌に対する影響を検討中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.リンパ球性漏斗下垂体後葉炎モデルの作成
コムギ胚芽を用いた無細胞翻訳系で、合成したリコンビナント76kD蛋白とCFAとを混合しエマルジョン作成に成功し、SJL/Jマウスに投与した結果採血し76kD抗体価が上昇していることを確認することが出来た。マウス下垂体組織の免疫組織化学的検討を行っているが、細胞浸潤が認められ、炎症が惹起されている可能性を得ている。
2.ES-AVPニューロンの分化誘導
マウスES細胞よりSFEBq/gfCDM法を用い、ES-AVP細胞を含む視床下部前駆細胞を選択的に分化誘導し、分散培養も行った。その培養系で、エレクトロポレーション法やリポソーム法を用いた遺伝子導入による76kD蛋白の過剰発現や、siRNAによるノックダウン実験に成功した。さらにES-AVP細胞でのAVP小胞に蛍光タンパク質を融合させ、time lapseイメージングでAVP小胞の可視化に成功した。また、全反射蛍光顕微鏡を用いた開口放出解析も可能になった。また、タンパク質間相互作用をPull-Down Assay、免疫沈降法で解析した結果、76kD蛋白との結合する蛋白が同定できた。

Strategy for Future Research Activity

下垂体炎組織の免疫組織学的解析をさらにすすめる。FACSも用いながら、リンパ球のたとえばT細胞については、T細胞CD4+CD25+とTh17など、マクロファージ/ミクログリアについては、サイトカイン、ケモカインなどの発現について解析する。また76kD蛋白で免疫した動物の脾臓から取り出したB細胞とミエローマ細胞を融合させた抗体産生B細胞ハイブリドーマを作出し、モノクローナル抗体を得て病態への関与を検討する。
マウスES細胞よりSFEBq/gfCDM法を用い分化誘導したES-AVPニューロンを用い、76kD蛋白ノックダウンのAVP分泌に対する影響を、全反射蛍光顕微鏡を用いた開口放出解析などのtime lapseイメージング、また、Pull-Down Assay、免疫沈降法で検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

試薬、実験動物、および実験器具の購入、入手のため105万円を予定している。また、北米神経科学学会参加を予定しておりその費用を30万円、またその他として15万円予定している。

  • Research Products

    (14 results)

All 2013 2012

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (8 results) Book (4 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results) (of which Overseas: 1 results)

  • [Journal Article] Lesion of area postrema attenuated hyperphagic responses to glucoprivation, but not transcriptional activation of the neuropeptide Y gene in rats.2012

    • Author(s)
      Ozawa Y, Arima H, Banno R, Ito Y, Goto M, Morishita Y, Sugimura Y, Ozaki N, Nagasaki H, Oiso Y.
    • Journal Title

      Neuroreport.

      Volume: 23 Pages: 673-675

    • DOI

      10.1097/WNR.0b013e3283556676.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Identification of a novel autoantigen and a diagnostic marker of autoimmune hypophysitis2012

    • Author(s)
      Yoshihisa Sugimura, Shintaro Iwama, Atsushi Kiyota, Hiroshi Takagi, Seiji Takeuchi, Hisakazu Izumida , Takuya Kato, Atsushi Enomoto, Yutaka Oiso
    • Organizer
      11th International Congress of Neuroimmunology
    • Place of Presentation
      Boston (米国)
    • Year and Date
      20121105-20121105
  • [Presentation] A rapid rise in serum sodium levels due to water diuresis as well as hypertonic saline administration in chronic hyponatremia causes osmotic demyelination syndrome2012

    • Author(s)
      Hiroshi Takagi, Yoshihisa Sugimura, Haruyuki Suzuki, Atsushi Kiyota, Kazuki Fukuoka, Yutaka Oiso
    • Organizer
      第35回日本神経科学大会、Neuroscience 2012
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場 (Nagoya)
    • Year and Date
      20120921-20120921
  • [Presentation] Involvement of Ras related proteins in AVP secretion in ES cell-derived AVP neurons2012

    • Author(s)
      Atsushi Kiyota, Yoshihisa Sugimura, Hiroshi Takagi, Kazuki Fukuoka, Takashi Watanabe, Hiroshi Nagasaki, Yutaka Oiso
    • Organizer
      第35回日本神経科学大会、Neuroscience 2012
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場 (Nagoya)
    • Year and Date
      20120919-20120919
  • [Presentation] Identification of a novel autoantigen and a diagnostic marker in lymphocytic infundibuloneurohypophysitis (LINH)2012

    • Author(s)
      Yoshihisa Sugimura, Shintaro Iwama, Atsushi Kiyota, Hiroshi Takagi, Takuya Kato, Atsushi Enomoto, Yutaka Oiso
    • Organizer
      第35回日本神経科学大会、Neuroscience 2012
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場 (Nagoya)
    • Year and Date
      20120918-20120918
  • [Presentation] Overly rapid correction of severe hyponatremia with vasopressin receptor antagonists poses a risk of inducing osmotic demyelination syndrome2012

    • Author(s)
      Hiroshi Takagi, Yoshihisa Sugimura, Haruyuki Suzuki, Atsushi Kiyota, Kazuki Fukuoka, Hiroshi Nagasaki, Yutaka Oiso
    • Organizer
      15th International and 14th European Congress of Endocrinology
    • Place of Presentation
      Florence (イタリア)
    • Year and Date
      20120508-20120508
  • [Presentation] Expression of Ras related proteins in ES cell-derived AVP secreting cells2012

    • Author(s)
      Atsushi Kiyota, Yoshihisa Sugimura, Hiroshi Takagi, Kazuki Fukuoka, Hiroshi Nagasaki, Yutaka Oiso
    • Organizer
      15th International and 14th European Congress of Endocrinology
    • Place of Presentation
      Florence (イタリア)
    • Year and Date
      20120507-20120507
  • [Presentation] SIADH2012

    • Author(s)
      椙村益久
    • Organizer
      第85回日本内分泌学会学術総会
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場 (Nagoya)
    • Year and Date
      20120421-20120421
  • [Presentation] リンパ球性漏斗下垂体後葉炎2012

    • Author(s)
      椙村益久
    • Organizer
      第85回日本内分泌学会学術総会
    • Place of Presentation
      名古屋国際会議場 (Nagoya)
    • Year and Date
      20120419-20120419
  • [Book] 低ナトリウム血症のすべて 低ナトリウム血症の症状―隠れている症状を探るー2013

    • Author(s)
      椙村益久
    • Total Pages
      5
    • Publisher
      メディカルレビュー社
  • [Book] 低ナトリウム血症と骨粗鬆症2012

    • Author(s)
      椙村益久、大磯ユタカ
    • Total Pages
      465-473
    • Publisher
      科学評論社
  • [Book] リンパ球性漏斗下垂体後葉炎2012

    • Author(s)
      椙村益久、大磯ユタカ
    • Total Pages
      243-244
    • Publisher
      診断と治療社
  • [Book] リンパ球性下垂体炎の自己抗体2012

    • Author(s)
      椙村益久、大磯ユタカ
    • Total Pages
      256-256
    • Publisher
      診断と治療社
  • [Patent(Industrial Property Rights)] リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のバイオマーカー及びその用途2012

    • Inventor(s)
      椙村益久ら
    • Industrial Property Rights Holder
      椙村益久ら
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      PCT/JP2012/079776
    • Filing Date
      2012-11-16
    • Overseas

URL: 

Published: 2014-07-24  

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