ＣＡＰ１遺伝子変異による急性骨髄性白血病の発症や再発機序の解明

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24591412
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 山口 博樹 日本医科大学, 医学部, 講師 (90297937)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: CAP1 / 急性骨髄性白血病 / 遺伝子変異

Research Abstract

性骨髄性白血病(AML)の発症には様々遺伝子変異が関与していることが明らかになった。しかしAMLの再発に関しては、白血病幹細胞などの関与が示唆されているが、これらの遺伝子変異の関与は明らかになっていない。我々は次世代シークエンサーを用いて発見したAMLの再発時に認められたCAP1遺伝子(CAP1)変異に注目をした。CAP1はアクチン結合タンパクのひとつであるが、近年アポトーシスへの関与が示唆された。本研究はCAP1変異を認めるAMLの臨床的特徴や、CAP1変異の白血病発症や再発の機序を明らかにすることを目的としている。
1.骨髄球性腫瘍におけるCAP1変異のスクリーニング
CAP1変異を認めるAMLの臨床的特徴を明らかにするために、AMLの初発検体200症例、AML再発検体30症例、骨髄異型性症候群の白血化15症例、骨髄増殖性腫瘍からの白血化4症例においてCAP1変異のスクリーニングを行った。AMLの初発検体では1症例に1塩基変異を、再発検体では1症例にNonsence変異、2症例にinsertionによるflame shift変異を認めたが、骨髄異型性症候群や骨髄増殖性腫瘍の白血化症例では変異を認めなかった。また4症例すべて染色体予後中間群であること以外は、明らかな臨床的特徴は認められなかった。
2.in vitroにおけるCAP1変異の機能解析
オリゴ合成にてwild typeのCAP1cDNAを合成し、AML症例で発見されたCAP1変異をwild type CAP1cDNAよりPCR法とmutagenesis法を基にクローニングした。そしてCAP1GFP発現AcGFP1ベクターでCAP1のwild typeとmutant typeを発現させたHela細胞、 HEK293T細胞、ヒト血球系GM‐CSF依存性細胞株のMO7e細胞やF-36P細胞を作製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初発時や寛解時検体または白血病幹細胞分画におけるCAP1変異の検索に関しては、研究立案当初はある程度の割合で新規のCAP1変異を有するAML症例を見出すことが出来て、初発時、寛解時、再発時の細胞凍結検体や保存DNA検体の解析が可能であると考えていた。しかし上述の骨髄球性腫瘍におけるCAP1変異のスクリーニングに記載したように、CAP1変異を認めるAML症例が4/249症例(1.6%)と少なかったため解析可能な細胞凍結検体や保存DNA検体を収集できなかった。
またin vitroやin vivoにおける機能解析に関しては、CAP1GFP発現AcGFP1ベクターでCAP1のwild typeとmutant typeを各細胞に発現させることに難渋した。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進方策としては、骨髄球性腫瘍におけるCAP1変異のスクリーニングを継続し解析症例数を増やす予定である。
またH24年度に作成したCAP1のwild typeとmutant typeを発現させたHela細胞、 HEK293T細胞、ヒト血球系GM‐CSF依存性細胞株のMO7e細胞やF-36P細胞を用いてin vitro、in vivoの機能解析を行う予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

骨髄球性腫瘍におけるCAP1変異のスクリーニングを継続するために次世代高速シークエンサーのライブラリ作製コスト、ビーズ調製、シーケンス反応コスト、変異のvalidationのためのdirect sequence法のシーケンス反応コストなどに合計で50万円必要である。
in vitro、in vivoの機能解析を継続するためにサイトカインなどの細胞培養消耗品、Mitotracker® Red CMXRos Mitochondria Probe(タカラバイオ)、ApoAlert®細胞分画キット (タカラバイオ)、shRNA合成、H2DCFDA probe(invitrogen)、 CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent(invitrogen)などに合計で64万円必要である。

Research Products

• [Journal Article] Mutations of the Epigenetics Modifying Gene (DNMT3a, TET2, IDH1/2) at Diagnosis may Induce FLT3-ITD at Relapse in de novo Acute Myeloid Leukemia (2013)
  • Author(s): Yamaguchi H, Wakita S, Omori I, et al.
  • Journal Title: Leukemia Volume: 27(5) Pages: 1044-1052
  • DOI: 10.1038/leu.2012.317.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 急性骨髄性白血病の今後の展望2013 (2013)
  • Author(s): 山口博樹
  • Journal Title: 臨床血液 Volume: 54(1) Pages: 39-48
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The clinical features and prognostic impact of DNMT3A gene mutation in Japanese patients with de novo AML (2012)
  • Author(s): Ryotokuji T, Yamaguchi H, Usuki K, Tajika K, Gomi S, Omori I, Sato Y, Todoroki T, Arai K, Kitano T, Mitamura Y, Kosaka F, Hirakawa T, Wakita S, Inokuchi K, Dan K.
  • Organizer: 第74回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 20121019-20121021
• [Presentation] The clinical features and prognostic impact of de novo acute myeloid leukemia with MLL-PTD (2012)
  • Author(s): Todoroki T, Yamaguchi H, Usuki K, Tajika K, Gomi S, Omori I, Sato Y, Arai K, Kitano T, Mitamura Y, Kosaka F, Ryotokuji T, Hirakawa T, Wakita S, Inokuchi K, Dan K
  • Organizer: 第74回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 20121019-20121021
• [Presentation] The clinical features and prognostic impact of de novo acute myeloid leukemia with RAS mutation (2012)
  • Author(s): Sato Y, Yamaguchi H, Usuki K, Tajika K, Gomi S, Omori I, Todoroki T, Arai K, Kitano T, Mitamura Y, Kosaka F, Ryotokuji T, Hirakawa T, Wakita S, Inokuchi K, Dan K.
  • Organizer: 第74回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 20121019-20121021
• [Presentation] The prognostic impact of Flt3 mutation in acute promyelocytic leukemia (2012)
  • Author(s): Hirakawa T, Yamaguchi H, Wakita S, Ryotokuji T, Kosaka F, Kitano T, Arai K, Omori I, Sato Y, Todoroki T, Dan K, Inokuchi K.
  • Organizer: 第74回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 20121019-20121021
• [Presentation] Comparative analysis of BHAC regimen and 3+7 regimen as induction for de novo acute myeloid leukemia (2012)
  • Author(s): Fukunaga K, Yamaguchi H, Ryotokuji T, Hirakawa T, Wakita S, Tamai H, Nakayama K, Nakamura K, Inokuchi K, Dan K.
  • Organizer: 第74回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 20121019-20121021
• [Presentation] The clinical features and prognostic impact of DNMT3A gene mutation in Japanese patients with de novo AML (2012)
  • Author(s): Wakita S, Yamaguchi H, Ryotokuji T, Takeuchi J, Omori I, Hirakawa T, Kitano T, Mitamura Y, Kosaka F, Inokuchi K, Dan K.
  • Organizer: 17th congress of the European hematology Association
  • Place of Presentation: Amsterdam, Netherlands
  • Year and Date: 20120614-20120617
• [Presentation] Stability of gene mutation in relapsed acute myeloid leukemia. (2012)
  • Author(s): Wakita S, Yamaguchi H, Omori I, Hirakawa T, Kitano T, Arai K, Mitamura Y, Kosaka F, Inokuchi K, Dan K.
  • Organizer: The 3rd JSH International Symposium
  • Place of Presentation: Kawagoe
  • Year and Date: 20120526-20120527
• [Presentation] The clinical features and prognostic impact of DNMT3A gene mutation in Japanese patients with de novo AML (2012)
  • Author(s): Ryotokuji T, Yamaguchi H, Omori I, Hirakawa T, Wakita S, Arai K, Kitano T, Mitamura Y, Kosaka F, Shimada T, Inokuchi K, Dan K.
  • Organizer: The 3rd JSH International Symposium
  • Place of Presentation: Kawagoe
  • Year and Date: 20120526-20120527