2012 Fiscal Year Research-status Report

患者口腔粘膜由来ｉＰＳ細胞を用いた疾患モデルシステムの構築と治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	24592801
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	三好圭子徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 講師 (20304537)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	野間隆文徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (40189428)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	疾患特異的口腔粘膜由来iPS細胞 / 口腔粘膜線維芽細胞 / ゴーシェ病
Research Abstract	今年度はゴーシェ病患者口腔粘膜由来iPS細胞の樹立と、患者由来口腔粘膜線維芽細胞を用いたGBA遺伝子変異の同定を行った。すでにゴーシェ病患者１例からインフォームドコンセントの後、口腔粘膜組織を採取し、線維芽細胞を分離後、レトロウィルスベクターにてリプログラミング4因子（OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC）を導入し、iPS様細胞を得ていたため、その性質を解析するところから開始した。まず得られたiPS細胞様クローンの中から６クローンについて、導入したリプログラミング遺伝子のmRNAレベルをRT-PCRにて確認し、サイレンシングが起きていることを確認した。次にESマーカー(NANOG, OCT4,SSEA4, TRA1-60)を免疫染色法にてタンパク質レベルで同定した。さらに、２クローンについて、①胚葉体形成実験および、②SCIDマウス精巣へのiPS細胞移植によるテラトーマ形成実験を行った。①では三胚葉由来組織マーカー(Neurofilament H, α-smooth muscle actin, α-fetoprotein等)が免疫染色法にて検出され、②ではテラトーマの薄切標本から、組織学的に多分化能を確認した。さらに４)核型解析を行い、正常な核型のクローンが樹立できており、ゴーシェ病患者口腔粘膜由来iPS細胞の樹立に成功した。一方、ゴーシェ病患者口腔粘膜線維芽細胞を用いたGBA遺伝子変異の同定は、ゲノムPCR法によりGBA遺伝子をいくつかのDNA断片としてクローニングし、シークエンスを行った。結果として、エクソンの２カ所に１塩基置換変異を同定した。別の手法として、SNaPshot解析によりこの変異を確認した。現在インフォームドコンセント後、同意を得たご家族の口腔粘膜組織を採取し、線維芽細胞を分離培養後、同様にGBA遺伝子のゲノムシークエンスを確認中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度の実験計画では、１）ゴーシェ病患者口腔粘膜由来iPS細胞の樹立、２）ゴーシェ病患者口腔粘膜線維芽細胞を用いた新規GBA遺伝子変異の確定、３）患者口腔粘膜由来iPS細胞からのin vitro疾患モデル系の確立、を掲げていた。１）と２）については達成できたが、３）患者口腔粘膜由来iPS細胞からの分化誘導が未だ着手できていない。理由としては、患者のご家族からご理解とご協力が得られたため、次年度に計画していたご家族からの口腔粘膜採取及び細胞培養等を、今年度から開始実験として繰り上げたためである。従って、結果としてはおおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	本研究課題は、難治性疾患の１つであるゴーシェ病患者の口腔粘膜からiPS細胞を樹立し、さらに疾患モデル細胞分化系を構築して、病態メカニズムの解明および新規遺伝子治療法の開発のための基礎研究を行い、再生医療における歯科の新たな役割を提示することを目的としている。平成24年度に患者由来PS細胞の樹立及び患者由来細胞を用いた原因遺伝子のGBA遺伝子の変異を同定し、ご家族からも高級粘膜組織の提供を受けることができたので、今後は当初に掲げた研究計画に従い、同定した遺伝子変異をin vitroで再現し、酵素活性等に与える影響等を確認する一方で病態を再現できるよう、iPS細胞から神経系への分化誘導系を確立する。それを応用して、さらにin vitro疾患モデル系を確立し、疾患の発症・病態メカニズムの分子レベルでの解析を行う。また、新旧治療薬のスクリーニングや遺伝子治療法等、新規治療法の開発に発展させる。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	該当なし